Materiali:
- Linea cellulare di interesse di mammifero (ad es. HeLa, COS-7)
- Terreno di coltura cellulare (ad esempio, terreno Eagle modificato di Dulbecco, DMEM)
- Siero fetale bovino (FBS)
- Soluzione antibiotica penicillina-streptomicina
- Materiali precursori del punto quantico (ad esempio, seleniuro di cadmio (CdSe) o sali di tellururo di cadmio (CdTe))
- Boroidruro di sodio (NaBH4)
- Acido L-ascorbico
- Polietilenimmina (PEI)
- Peptide del segnale di localizzazione nucleare (NLS).
- Reagente di trasfezione (ad es. Lipofectamina 2000)
Procedura:
1. Coltura cellulare:
- Mantenere la linea cellulare di mammifero di interesse in un mezzo di coltura cellulare integrato con FBS e soluzione antibiotica penicillina-streptomicina.
- Piastrare le cellule su vetrini coprioggetto o in piastre di coltura per microscopia e altre analisi.
2. Sintesi dei precursori dei punti quantici:
- Preparare una soluzione madre del materiale precursore del punto quantico (ad esempio sali di CdSe o CdTe) in un solvente adatto (ad esempio cloroformio o dimetilformammide).
- Per i punti quantici di CdSe, sciogliere il sale di CdSe in triottilfosfina (TOP) e aggiungere ossido di triottilfosfina (TOPO) come agente stabilizzante.
- Per i punti quantici CdTe, sciogliere il sale CdTe in TOP e aggiungere polvere di tellurio e TOPO.
3. Coniugazione peptidica mirata al nucleo:
- Coniugare la soluzione del precursore del punto quantico con il peptide NLS per garantire la localizzazione nucleare.
- Mescolare il peptide NLS con la soluzione del precursore del punto quantico e agitare per diverse ore o durante la notte.
- Purificare la soluzione del precursore del punto quantico coniugato con NLS mediante centrifugazione o filtrazione su membrana.
4. Sintesi di punti quantici all'interno delle cellule:
- Trasfettare le cellule con la soluzione del precursore del punto quantico coniugato con NLS utilizzando un reagente di trasfezione adatto (ad esempio, Lipofectamina 2000).
- Seguire le istruzioni del produttore per il protocollo di trasfezione.
- Incubare le cellule per un tempo sufficiente (ad esempio 24-48 ore) per consentire la sintesi dei punti quantici all'interno del nucleo.
5. Riduzione e stabilizzazione:
- Dopo l'incubazione, trattare le cellule con un agente riducente (ad esempio NaBH4) e un agente stabilizzante (ad esempio acido L-ascorbico) per ridurre i precursori dei punti quantici e migliorarne la stabilità.
- Preparare una soluzione fresca di NaBH4 e acido L-ascorbico nel terreno di coltura cellulare.
- Aggiungere la soluzione di agente riducente e stabilizzante alle cellule e incubare per un breve periodo (ad esempio 1-2 ore).
6. Imaging e analisi:
- Utilizzare la microscopia a fluorescenza per visualizzare i punti quantici cresciuti all'interno del nucleo delle cellule vive.
- La microscopia confocale o le tecniche di imaging a super risoluzione possono fornire informazioni dettagliate sulla localizzazione e la morfologia dei punti quantici.
- Analizzare le proprietà ottiche dei punti quantici, come spettri di emissione, intensità e fotostabilità, per valutarne la funzionalità e l'idoneità per applicazioni specifiche.
Considerazioni aggiuntive:
- La scelta dei materiali precursori dei punti quantici e le condizioni per la sintesi possono influenzare la dimensione, la forma e la composizione dei punti quantici formati all'interno delle cellule.
- L'ottimizzazione delle condizioni di trasfezione e sintesi potrebbe essere necessaria per ottenere un'efficiente localizzazione nucleare e una formazione di punti quantici.
- Per garantire un'interpretazione accurata dei risultati, dovrebbero essere inclusi controlli appropriati, come cellule trattate con precursori di punti quantici non coniugati o cellule senza trasfezione.
Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono far crescere con successo punti quantici direttamente all’interno del nucleo delle cellule vive, consentendo l’esplorazione di nuove strade nel bioimaging su scala nanometrica, nella nanoingegneria cellulare e nella nanomedicina.
