Un gruppo di chimici dell'Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Università di Nagoya, ha sviluppato un nuovo colorante fluorescente fotostabile che emette nel vicino infrarosso (NIR) PREX 710 (colorante xantenico fotoresistente che può essere eccitato a 710 nanometri) per avere usi che vanno dall'imaging a molecola singola a lungo termine all'imaging profondo in vivo, secondo uno studio riportato sulla rivista Angewandte Chemie Edizione Internazionale .

PREX 710 ha una struttura molecolare costituita da una porzione di ossido di fosfina (P=O) al posto dell'ossigeno nel suo nucleo di xantene triciclico fuso, e 2 gruppi metossi (OMe) sull'anello aromatico periferico, che consente al colorante di assorbire ed emettere nella regione NIR, e spiega la sua elevata chimica e fotostabilità, rispettivamente. Inoltre, l'estere PREX 710 NHS può essere chimicamente legato a biomolecole comprese proteine, zuccheri, e piccoli ligandi organici, che può portare all'osservazione di varie strutture ed eventi nelle cellule vive.

Insieme ai ricercatori di RIKEN e della Ehime University, il team ha scoperto che PREX 710 potrebbe essere utilizzato per l'imaging fluorescente a singola molecola in condizioni fisiologiche. L'elevata fotostabilità del PREX 710 consente immagini ripetute, e le sue proprietà specifiche di assorbimento/emissione di luce nella regione NIR, consente l'imaging multicolore con il suo utilizzo con altri coloranti fluorescenti. Inoltre, collegando l'estere PREX 710 NHS a un polisaccaride (destrano), il team è riuscito nell'imaging 3D in vivo in profondità dei vasi sanguigni nel cervello dei topi. Ciò è stato reso possibile dall'elevata stabilità chimica di PREX 710 all'interno del flusso sanguigno, così come dall'uso della radiazione NIR per guardare in profondità all'interno dei tessuti. L'elevata fotostabilità, solubilità in acqua e stabilità chimica, insieme alla sua bassa citotossicità, e l'uso della radiazione NIR rende PREX 710 un potente strumento per visualizzare processi e strutture molecolari per lunghi periodi senza fotosbiancamento all'interno degli organismi viventi.

L'imaging a fluorescenza è una tecnica in cui una proteina specifica o un organello cellulare viene etichettato con una sonda fluorescente e viene utilizzato per visualizzare processi e strutture di organismi al microscopio a fluorescenza. Sebbene molti agenti di etichettatura fluorescenti, come proteine ​​fluorescenti e piccole molecole organiche fluorescenti sono state sviluppate fino ad ora, la maggior parte di loro utilizza radiazioni nella regione visibile. Gli svantaggi dell'utilizzo della luce visibile come le luci blu o verdi derivano dalla sua elevata energia, che possono causare danni ai campioni viventi se esposti per lunghi periodi. Inoltre, quando i campioni sono eccitati con luce visibile, l'autofluorescenza dei campioni stessi tende ad interferire con i segnali delle sonde fluorescenti. È anche noto che le biomolecole come l'emoglobina tendono ad assorbire la luce visibile, così la luce non arriva in profondità all'interno degli organismi, che ha reso difficile visualizzare vasi sanguigni e organi vivi.

Questi problemi derivanti dall'imaging con luce visibile potrebbero essere superati utilizzando le radiazioni NIR, che ha una lunghezza d'onda maggiore, quindi minore energia, rispetto alla luce visibile. Ciò nonostante, molti dei coloranti NIR sviluppati finora sono basati su coloranti cianinati, che consistono in catene di polimetiniche (gruppi di metina (CH) collegati da legami alternati singoli e doppi) che hanno eterocicli contenenti azoto attaccati a ciascuna estremità della catena. La maggior parte dei coloranti alla cianina soffre di bassa chimica e fotostabilità, rendendo così difficile il bioimaging a lungo termine con questi coloranti a causa del fotosbiancamento nel tempo. Sebbene possano essere aggiunti agenti anti-sbiadimento per prevenire il fotosbiancamento, potrebbero non essere applicabili negli esperimenti su cellule vive.

"Il gruppo Yamaguchi è interessato a produrre coloranti fotostabili per bioimmagini che assorbono ed emettono in diverse lunghezze d'onda, "dice il dottor Masayasu Taki, un professore associato nel gruppo del professor Shigehiro Yamaguchi presso ITbM, e uno dei leader di questo studio. "È noto che le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione dei coloranti aumentano con l'aumento dei doppi legami coniugati nella sua struttura, ma più anelli complicano la sintesi e portano anche a una bassa solubilità in acqua, che non è l'ideale per l'imaging in condizioni fisiologiche. Abbiamo quindi deciso di sintetizzare diversi coloranti modificando gli elementi sull'anello xantenico centrale da ossigeno a fosforo".

"Dottor Marek Grzybowski, un ricercatore post-dottorato nel nostro gruppo, ha lavorato a questo progetto, e ha ideato la sintesi di molti dei coloranti fluorescenti a base di rodamina recentemente sviluppati nel nostro gruppo, " descrive Taki.

Durante i loro studi, il gruppo ha anche riscontrato che uno dei derivati ​​del PREX 710 era suscettibile di attacco verso una forma ridotta di glutatione (GSH), che è un tripeptide che agisce come antiossidante nelle cellule. Sebbene la decolorazione dei coloranti da parte del GSH sia generalmente considerata un inconveniente nell'imaging dal vivo fluorescente, il gruppo ha pensato che questo colorante potesse fungere da promettente sonda NIR per monitorare il livello di GSH nelle cellule e nei tessuti viventi.

"Dopo aver sintetizzato e testato vari derivati ​​xantenici, abbiamo trovato PREX 710, che ha mostrato un'eccezionale chimica e fotostabilità, e quindi dimostrato di essere un pratico fluoroforo emissivo NIR, che a sua volta è permeabile alla membrana e si localizza principalmente nei mitocondri delle cellule HeLa viventi, " spiega Taki. "Siamo stati davvero entusiasti di vedere che utilizzando PREX 710, potremmo visualizzare i componenti delle cellule vive per molti minuti rispetto ai pochi secondi che si potrebbero ottenere con i coloranti convenzionali".

In collaborazione con il Dott. Yasushi Okada, un team leader presso il RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, il team ha scoperto che PREX 710 è applicabile per l'imaging fluorescente a singola molecola, una tecnica che è nota per richiedere una forte radiazione luminosa. I loro studi mostrano che nelle stesse condizioni sperimentali, L'80% dei segnali fluorescenti a singola molecola da PREX 710 potrebbe essere rilevato per 2 minuti, mentre la metà dei segnali è scomparsa entro 20 secondi con Alexa Fluor 647 (colorante cianinato). Gli esperimenti dimostrano che PREX 710 può visualizzare chiaramente ogni singola molecola per periodi prolungati senza alcun fotosbiancamento in assenza di agenti anti-fading.

Inoltre, il team è stato in grado di utilizzare PREX 710 nell'imaging multicolore di cellule HeLa vive. Poiché le proprietà di eccitazione ed emissione NIR di PREX 710 differiscono dai coloranti fluorescenti a luce visibile, la diafonia spettrale può essere evitata per visualizzare i componenti cellulari ciascuno colorato con coloranti diversi. Per esempio, l'imaging multicolore di cellule HeLa vive è stato possibile dopo aver colorato la membrana cellulare, nucleo e mitocondri con coloranti fluorescenti disponibili in commercio come DiI e SiR-DNA, insieme a PREX 710, rispettivamente.

L'utilità pratica di PREX 710 è stata dimostrata anche applicando la sonda per l'imaging profondo in vivo, che è stato realizzato in collaborazione con la dott. Takeshi Imamura e Ryosuke Kawakami dell'Università di Ehime. Utilizzando il sito di bioconiugazione di PREX 710, destrano, un polisaccaride composto da molecole di glucosio, è stato marcato con fluorescenza e iniettato nel flusso sanguigno attraverso la vena della coda del topo. L'immagine 3-D dei vasi sanguigni nel cervello di topo potrebbe essere costruita grazie all'elevata luminosità di PREX 710 nella regione NIR che consente la registrazione dei segnali di fluorescenza nei tessuti profondi.

"Siamo stati lieti di dimostrare che PREX 710 e i suoi derivati ​​sono strumenti utili per lo studio della dinamica degli organismi viventi, tessuti, cellule, e molecole, ", afferma Taki. "Stiamo attualmente lavorando allo sviluppo di altre sonde a fluorescenza NIR che potrebbero essere utilizzate per la colorazione di proteine ​​specifiche e per l'esame più approfondito di strutture e processi vivi. Speriamo che questo porti alla visualizzazione e al chiarimento di vari fenomeni nei sistemi viventi, compresi i sintomi medici, " lui dice.