Le cellule osservate su una diapositiva posta sotto un microscopio vengono contate usando uno strumento di laboratorio comune noto come ematometro o camera di conteggio delle cellule, in combinazione con un colorante di esclusione chiamato Trypan blu. La tintura macchia le cellule morte in blu, ma non può entrare nelle cellule vive, che appariranno come sfere luminose e bianche attraverso l'oculare del microscopio. Gli scienziati devono contare le cellule per posizionare il numero corretto di cellule in un terreno di coltura cellulare o reagente sperimentale per la quantificazione e l'analisi o semplicemente per impedire alle cellule di crescere troppo.
Determinare il tipo di ematometro (ad esempio Neubauer) in uso. Si tratta di vetrini per microscopia fondamentalmente spessi contenenti un'area centrale incisa con griglie di conteggio. Posizionare questo sotto il microscopio impostato su un ingrandimento basso (10-20X) e regolare la messa a fuoco degli obiettivi fino a visualizzare le griglie di conteggio inviduali.
Preparare una sospensione cellulare. Utilizzare la tripsina enzima per rompere il tessuto in singole cellule e quindi neutralizzare la tripsina con il siero. Lavare e agitare le cellule e risospendere in media o soluzione salina. Elimina i grumi di cellule pipettando delicatamente su e giù. Se la sospensione appare torbida, diluire ulteriormente con più soluzione salina.
Utilizzare Trypan blue per escludere le cellule morte. Trasferire 10-20 microlitri di sospensione cellulare in un tubo sterile e mescolare con lo stesso identico volume di colorante blu Trypan pipettando delicatamente. Questo diluisce la sospensione cellulare 1: 2 in Trypan blu.
Prepara l'ematometro. Pulire con etanolo al 70%, asciugare all'aria e posizionare un vetrino coprioggetto sulle griglie di conteggio. Nello "scarico" nella parte superiore di ogni griglia, posizionare 10 microlitri di sospensione cellulare e consentire al "drenaggio" di tirarlo sotto il coprioggetto. Ripeti per questa altra griglia di conteggio finché entrambi hanno uno strato uniforme di sospensione cellulare.
Contare il numero di celle usando il contatore manuale. Le cellule viventi rifletteranno la luce e appariranno brillanti, biancastre e sferiche. Le celle blu sono morte o danneggiate e non dovrebbero essere contate a meno che non siano richiesti numeri di cellulare non vitali. Ripeti per tutte e 8 le griglie di conteggio e poi prendi la media. Ad esempio, se 800 celle vengono contate in 8 griglie, la media per griglia è di 100 celle.
Calcola la densità della cella nella sospensione originale. Applicare il numero medio di cellule alla seguente formula: Concentrazione cellulare = Numero medio di cellule Fattore di diluizione X 10.000 X (= 2, se la diluizione è 1: 2) Volume di sospensione X (in millilitri, regolare secondo necessità per microlitri e così via ).
Pulisci l'ematometro. Lavare la sospensione cellulare, pulire l'emocrometro con candeggina e /o isopropanolo al 70% o inondare con etanolo al 70%. Lasciare asciugare o asciugare con un panno privo di lanugine e gettare tutte le sospensioni sospese di cellule in contenitori a rischio biologico.
Avviso
Il blu di Trypan è un agente mutageno e macchie permanenti, quindi assicurati di indossare indumenti protettivi e i guanti sono indossati prima di procedere.
