La reazione a catena della polimerasi, o PCR, è una tecnica che fotocopia un frammento di DNA in molti frammenti, molti in modo esponenziale. Il primo passo è nella PCR è quello di riscaldare il DNA in modo che si denatura, o si scioglie in singoli filamenti. La struttura del DNA è come una scala di corda in cui i pioli sono funi con estremità magnetiche. I magneti si collegano per formare i pioli, chiamati coppie di basi, e quindi resistono all'essere separati. Ogni frammento di DNA si fonde in singoli filamenti a diverse temperature. Comprendere in che modo la struttura del DNA è tenuta insieme dalle singole parti del DNA fornirà informazioni sul perché diversi frammenti di DNA si fondono a temperature diverse e perché in primo luogo sono necessarie temperature così elevate.
Fusione! Fusione!
Il primo passo della PCR è quello di fondere il DNA in modo che il DNA a doppio filamento si separi in DNA a filamento singolo. Per il DNA dei mammiferi, questo primo passo di solito comporta un calore di circa 95 gradi Celsius (circa 200 gradi Fahrenheit). A questa temperatura i legami di idrogeno tra le coppie di basi A-T e G-C, o i pioli nella scala del DNA, si sfaldano, decomprimendo il DNA a doppio filamento. Tuttavia, la temperatura non è abbastanza calda per rompere la spina dorsale di zucchero fosfato che forma i singoli fili o i poli della scala. La separazione completa dei singoli filamenti li prepara per la seconda fase della PCR, che si sta raffreddando per consentire brevi frammenti di DNA, chiamati primer, per legare i singoli filamenti.
Chiusure magnetiche
Una ragione per cui il DNA è riscaldato alla temperatura elevata di 95 gradi Celsius è che più lungo è il doppio filamento del DNA, più esso vuole stare insieme. La lunghezza del DNA è un fattore che influenza il punto di fusione scelto per la PCR su quel pezzo di DNA. Le coppie di basi A-T e G-C nel DNA a doppio filamento si legano l'una con l'altra per mantenere insieme la struttura a doppio filamento. Più coppie di basi consecutive si uniscono tra due cordoni singoli, più i loro vicini vogliono anche legarsi e più forte diventa l'attrazione tra i due fili. È come una cerniera fatta di piccoli magneti. Mentre chiudi la cerniera, i magneti vorranno naturalmente comprimere e rimanere zippati.
I magneti più potenti attaccano più strettamente
Un altro fattore che influisce sulla temperatura di fusione da scegliere per il tuo frammento di DNA di interesse è la quantità di coppie di basi GC presenti in quel frammento. Ogni coppia base è come due mini-magneti che attraggono. Una coppia fatta di G e C è molto più attratta di una coppia A e T. Quindi un pezzo di DNA che ha più coppie G-C di un altro frammento richiederà una temperatura più elevata prima di fondersi in singoli filamenti. Il DNA assorbe naturalmente la luce ultravioletta - per la lunghezza d'onda di 260 nanometri, per la precisione - e il DNA a singolo filamento assorbe più luce del DNA a doppio filamento. Quindi misurare la quantità di luce assorbita è un modo per misurare quanto il tuo DNA a doppio filamento si è sciolto in singoli filamenti. L'effetto "cerniera magnetica" delle coppie di basi G-C e A-T è ciò che fa sì che un grafico dell'assorbanza di luce del DNA a doppio filamento tracciato contro un aumento di temperatura sia sigmoidale, a forma di S, e non una linea retta. La curva della S rappresenta la resistenza di lavoro di squadra che le coppie di basi esercitano contro il calore perché non vogliono separarsi.
Il punto intermedio
La temperatura alla quale si fonde una lunghezza di DNA in single strands è chiamata la sua temperatura di fusione, che è indicata con la sigla "Tm". Questo indica la temperatura alla quale metà del DNA in una soluzione si è sciolta in singoli filamenti e l'altra metà è ancora in forma di doppio filamento. La temperatura di fusione è diversa per ogni frammento di DNA. Il DNA dei mammiferi ha un contenuto G-C del 40%, il che significa che il restante 60% delle coppie di basi sono As e Ts. Il suo contenuto di G-C del 40% provoca la fusione del DNA dei mammiferi a 87 gradi Celsius (circa 189 gradi Fahrenheit). Questo è il motivo per cui il primo passo della PCR sul DNA dei mammiferi è di riscaldarlo a 94 gradi Celsius (201 gradi Fahrenheit). Solo sette gradi più caldi della temperatura di fusione e tutti i doppi ciocche si fondono completamente su singoli filamenti.
