Metodi per ottenere cloni a cellula singola
1. Clonazione di diluizione (diluizione limitata)
- Principio: Diluire la sospensione cellulare a una concentrazione abbastanza bassa che le singole cellule sono separate e placcate in singoli pozzi o punti.
- Procedura:
- 1. Preparazione: Determina la concentrazione approssimativa cellulare della tua coltura usando un emocitometro o un contatore cellulare.
- 2. Diluizione: Calcola il fattore di diluizione necessario per ottenere una densità cellulare desiderata (ad es. 1 cellula per pozzetto). Dilui la sospensione cellulare di conseguenza.
- 3. Placcatura: Piastra le cellule diluite in una piastra multi-pozzo (96 pozzetti, 24 pozzetti, ecc.) O su una piastra di Petri.
- 4. Incubazione: Consentire alle cellule di crescere e formare colonie.
- 5. Selezione: Identificare pozzi o aree con singole colonie (una cellula ha dato origine a tutta la colonia).
2. Micromanipulation (selezione microscopica)
- Principio: Usando un microscopio e un micromanipulatore per raccogliere fisicamente una singola cellula e trasferirla su un nuovo mezzo di crescita.
- Procedura:
- 1. Preparazione: Usa un microscopio con un micromanipulatore.
- 2. Selezione delle cellule: Identificare una singola cella di interesse al microscopio.
- 3. Isolamento: Usa attentamente il micromanipulatore per raccogliere la cellula.
- 4. Trasferimento: Trasferire la cellula su un nuovo mezzo di crescita (ad esempio un piccolo piatto di coltura o un microtubo).
- 5. Incubazione: Consentire alla cellula di crescere in una colonia.
3. Sorteing basato su citometria a flusso
- Principio: Utilizzando un citometro a flusso per ordinare le cellule in base a caratteristiche specifiche (ad es. Dimensione, fluorescenza).
- Procedura:
- 1. Etichettatura: Se necessario, etichettare le cellule con marcatori fluorescenti per differenziarle dagli altri.
- 2. Ordinamento: Eseguire la sospensione cellulare attraverso il citometro a flusso. Lo strumento analizza e separa le cellule in base ai parametri specificati.
- 3. Collezione: Raccogli cellule di interesse in un nuovo mezzo di crescita.
- 4. Incubazione: Consentire alle cellule di crescere in colonie.
Considerazioni per la clonazione a cella singola
* Tipo di cella: Diversi tipi di cellule hanno caratteristiche di crescita diverse. Alcuni sono più sensibili all'isolamento rispetto ad altri.
* Medium di crescita: La scelta del terreno di coltura è fondamentale per supportare la crescita singola.
* Clone Purity: Assicurarsi che le colonie selezionate provengano da una singola cella.
* Tempo: La clonazione può richiedere del tempo, poiché le singole cellule devono moltiplicarsi in una colonia.
* Applicazioni:
- Sviluppo della linea cellulare: Creazione di linee cellulari pure con proprietà specifiche.
- Screening del farmaco: Testare gli effetti del farmaco sulle singole cellule.
- Ricerca genetica: Studiare l'espressione genica e le mutazioni a livello di singola cellula.
Fammi sapere se desideri maggiori dettagli su uno di questi metodi o hai domande su applicazioni specifiche!
