1. Costruzione di vettori di targeting genico 2. Trasformazione della pianta 3. Selezione della pianta di prima generazione 4. Valutazione dell'efficienza della distruzione genica 5. Insorgenza di eventi di modifica del genoma 6. Selezione di piante che hanno perso gli strumenti di distruzione del gene (prevenendo modifiche imprevedibili/extra del genoma) 7. Selezione di piante contenenti mutazione del gene bersaglio 8. Stabilire una linea mutante/pubblicare una raccolta. Credito:assistente professore Takashi Ishida
Gli ormoni peptidici sono importanti regolatori della crescita che svolgono vari ruoli in molti organismi. Sebbene l'importanza dei geni che codificano per gli ormoni peptidici sia ampiamente riconosciuta, la maggior parte dei peptidi deve ancora essere caratterizzata funzionalmente. Utilizzando la tecnologia di modifica del genoma, ricercatori dell'Università di Kumamoto, Il Giappone ha generato un nuovo, raccolta completa di risorse genetiche di piante con geni codificanti peptidi CLE eliminati. I peptidi CLE sono un gruppo di ormoni peptidici specifici della pianta che svolgono un ruolo nella segnalazione cellulare e sono regolati dai geni CLE. Si prevede che questa raccolta aperta contribuirà a studi futuri su come funzionano gli ormoni peptidici nelle piante.
Modifica del genoma, una tecnologia che ci consente di eliminare o modificare geni specifici, è stato recentemente sotto i riflettori. Il metodo "CRISPR/Cas9" è stato istituito nel 2013 con casi di successo di modifica del genoma riportati negli animali, lieviti, impianti, e molti altri organismi. Prima di CRISPR/Cas9, l'editing del genoma richiedeva procedure complicate e quindi non era popolare nella ricerca che mirava a più geni. La costituzione di CRISPR/Cas9, d'altra parte, ha portato grandi progressi all'editing del genoma grazie alla sua elevata efficienza, alta specificità del bersaglio, e semplicità. A causa di questi vantaggi, i ricercatori hanno ottenuto un modo per studiare la funzione dei geni, come l'analisi dell'impatto dell'eliminazione di geni specifici sul comportamento di organismi e/o cellule.
I recenti progressi nella scienza delle piante hanno scoperto varie aree in cui gli ormoni peptidici forniscono informazioni preziose nei cicli di vita delle piante, per esempio determinare il numero di cellule e la dimensione dei tessuti, controllo dell'impollinazione, e rispondere ai cambiamenti climatici o alle malattie. Molti scienziati stanno attualmente effettuando ricerche sulla genetica delle piante perché i geni per molti ormoni peptidici non caratterizzati non sono ancora stati scoperti. Anche se i geni che codificano per gli ormoni peptidici sono difficili da studiare, possono generare una ricchezza di risorse genetiche per la ricerca futura.
Arabidops i mutanti privi del peptide CLV3 hanno una maggiore quantità di tessuto del frutto. Credito:assistente professore Takashi Ishida
Usando CRISPR/Cas9, il team di ricerca dell'Università di Kumamoto ha tentato di accelerare la ricerca sugli ormoni peptidici vegetali. Hanno selezionato Arabidopsis thaliana, una pianta modello con 32 geni che codificano per i peptidi CLE, e ha generato una raccolta di strumenti di knockout genico che corrispondeva a ciascuno dei 32 geni. Istituendo questi mutanti Arabidopsis linee di piante, hanno permesso di indagare più facilmente sulla funzione di ciascun gene.
Per valutare l'efficacia del gene knockout, il team di ricerca ha esaminato CLV3, il peptide CLE più studiato. È noto per avere un ruolo nella soppressione delle divisioni cellulari nei punti di crescita degli steli. Come previsto, il mutante CLV3 delle piante di Arabidopsis ha prodotto frutti di forma irregolare a causa di un aumento del numero di cellule.
Per di più, i ricercatori sono stati in grado di utilizzare le piante mutanti per realizzare quello che si ritiene sia il primo rapporto sulla rilevanza biologica del gene CLE44. Sebbene ci si aspettasse che CLE44 regoli il numero di cellule nel fascio vascolare, la ricerca su tale ipotesi non era stata eseguita a causa di risorse biologiche insufficienti. Con l'aiuto delle loro linee di piante mutanti di nuova concezione, i ricercatori dell'Università di Kumamoto hanno osservato una diminuzione del numero di cellule del fascio vascolare nelle piante mutanti CLE44, confermando così il suo ruolo nello sviluppo vascolare.
Le cellule procambiali regolate da CLE44 sono mostrate in azzurro. Nel mutante del peptide CLE44, il numero di cellule è diminuito. Credito:assistente professore Takashi Ishida
"La nostra raccolta di risorse genetiche ha il potenziale per aiutare a studiare ormoni peptidici sconosciuti come CLE44, ", ha affermato l'assistente professore Takashi Ishida dell'Università di Kumamoto. "Ci auguriamo che questo approccio diventi un modello per ricerche simili in futuro".
Questa ricerca è stata pubblicata online in Fisiologia vegetale e cellulare il 25 settembre 2017, e sarà presentato come "Ricerca in evidenza" in un prossimo volume della rivista.
