Un sensore su un sensore:la luce laser (rossa) viene irradiata (in alto) in una microsfere di vetro a cui è fissata una nanobarra d'oro. La luce laser corre intorno all'interno della microsfere e si concentra sull'asta d'oro, a cui le biomolecole (in questo caso le proteine) possono attaccarsi (in basso). Quando la molecola si muove, modificando la misura in cui si sovrappone al campo luminoso, il sensore produce un segnale. Ciò consente di osservare enzimi e movimenti enzimatici senza utilizzare un marker. Credito:Frank Vollmer / Science Advances
I ricercatori dell'Istituto Max Planck per la scienza della luce di Erlangen hanno sviluppato una tecnica per osservare direttamente come gli enzimi e altre biomolecole svolgono il loro lavoro, con benefici medici e scientifici potenzialmente significativi. Utilizzando questa tecnica, loro hanno, per la prima volta con solo luce e senza pennarello, osservati cambiamenti conformazionali nella DNA polimerasi, l'enzima responsabile della replicazione del DNA. Poiché la tecnica può essere utilizzata anche per studiare come gli enzimi svolgono il loro lavoro, potrebbe aiutare a identificare nuovi meccanismi per lo sviluppo di farmaci.
Quando i biologi guardano attraverso un microscopio moderno, quello che vedono è un po' quello che potresti vedere se guardassi lungo un'autostrada di notte:i veicoli sono visibili solo dai loro fari ed è impossibile dire se i fari appartengono a un'auto o a un camion, o se un'auto parcheggiata sta aprendo la portiera. Attualmente, i biologi possono osservare solo gli enzimi che svolgono il loro lavoro indirettamente. Attaccano i coloranti fluorescenti ai singoli componenti delle biomolecole e poi osservano i punti di luce che si muovono al microscopio. Possono vedere molto poco di come sta cambiando la forma dell'enzima. Inoltre, avere una molecola colorante attaccata ad essa significa che l'enzima che stanno osservando non è nel suo stato naturale. Non si può escludere che tali molecole di colorante possano influenzare la funzione dell'enzima.
Un team di ricercatori guidato da Frank Vollmer, fino a poco tempo fa capo di un gruppo di ricerca presso il Max Planck Institute for the Science of Light e ora professore all'Università di Exeter, ha, però, sviluppato una tecnica per consentire loro di osservare gli enzimi senza attaccare un marcatore fluorescente.
Un nanorod concentra la luce su un'area di pochi nanometri
Il loro strumento microscopicamente piccolo è effettivamente un sensore su un sensore. Una nanobarra d'oro di circa 10 nanometri di diametro e 40 nanometri di lunghezza è attaccata a una microsfere di vetro con un diametro di circa 80 micrometri (1 micrometro =1/1000 di millimetro). Un'onda leggera, prodotto da un laser, viene inviato sfrecciando attorno al bordo interno di questa microsfere. Poiché questa onda si sovrappone leggermente al bordo della microsfere, interagisce con il nanorod attaccato.
Dare una mano:il sensore è in grado di rilevare quando una molecola di DNA polimerasi si lega alla nanobarra d'oro di un nanosensore plasmonico e sintetizza un filamento di DNA. Durante questo processo l'enzima si apre e si chiude come una mano, cambiando la misura in cui si sovrappone al punto luminoso sul nanorod d'oro. Questo cambia la lunghezza d'onda della luce che ingrandisce l'interno della microsfere. I ricercatori usano questo cambiamento nella lunghezza d'onda come misura dell'estensione della sovrapposizione. Credito:Frank Vollmer / Science Advances
Questa interazione inizia piuttosto debole, ma la microperla agisce come una galleria sussurrante:in una rotonda, una parola sussurrata lungo il muro si sente chiaramente dall'altra parte, perché l'onda sonora segue la curva della parete anziché disperdersi in tutte le direzioni. Nello stesso modo, l'onda luminosa che gira in tondo all'interno della microsfere passa il nanorod d'oro migliaia di volte in uno spazio di tempo estremamente breve, amplificando l'interazione con il nanorod.
Il nanorod estrae la luce che si sovrappone ulteriormente al bordo della microsfere. Il risultato è un'area di luce concentrata come un faretto della stessa dimensione dell'asta, cioè solo pochi nanometri di diametro. Se un enzima o un'altra molecola si lega al nanorod d'oro, è immerso in questo riflettore. Il segnale prodotto dal sensore dipende dalla molecola posizionata nel riflettore e da come si muove all'interno di questa luce. Ciò consente ai ricercatori di indagare e registrare i movimenti di una singola molecola enzimatica.
Segnali diversi per diverse conformazioni enzimatiche
La tecnica si basa su un fenomeno noto come plasmonica. Applicato a minuscole strutture metalliche come nanotubi, la plasmonica permette di concentrare la luce su un'area di pochi nanometri. "Questo ci permette di ridimensionare la luce fino alle dimensioni di un enzima, " spiega Frank Vollmer del Max Planck Institute for the Science of Light di Erlangen. E ancora di più, i ricercatori di Erlangen sono persino riusciti a utilizzare la loro tecnica per sondare i singoli ioni.
In un esperimento, i fisici hanno attaccato l'enzima DNA polimerasi al loro sensore e poi hanno cercato di registrare come si muove. La DNA polimerasi assomiglia a una mano che stringe un tubo - il tubo in questo caso è il filamento di DNA che sta elaborando. Questa "mano" produce un segnale diverso quando è aperta e quando è chiusa, poiché questo cambia la dimensione della sovrapposizione tra il punto luminoso e l'enzima. Ciò ha permesso ai ricercatori di registrare in tempo reale come l'enzima si apre e si chiude. "Un ulteriore perfezionamento della nostra tecnica dovrebbe consentirci di fare cose come registrare direttamente la sintesi di un filamento di DNA da parte dell'enzima polimerasi, " spiega Vollmer. I biochimici sarebbero quindi in grado di osservare in tempo reale come l'enzima copia le informazioni genetiche e persino di utilizzare il segnale prodotto dal nanosensore per il sequenziamento del DNA.
Rilevamento di singoli ioni:il sensore è così sensibile che il segnale mostra anche quando un singolo ione si lega alla punta del nanorod (mostrato in forma schematica qui) attaccato alla microsfere di vetro. Credito:Frank Vollmer / Nature Photonics
Gli esperimenti che utilizzano la nuova tecnica sono stati in grado di osservare più di come si muovono gli enzimi. "L'abbiamo usato per osservare la dipendenza dalla temperatura dell'attività enzimatica, " spiega Frank Vollmer. Questo offre un modo semplice per eseguire studi termodinamici. Tali studi possono fornire informazioni su caratteristiche come l'energia di attivazione di un enzima, spiega il fisico. L'energia di attivazione è una misura dell'efficienza di questi catalizzatori biologici.
Il nanosensore può essere utilizzato per osservare le reazioni chimiche
Per dimostrare quanto piccole possano essere le particelle che possono essere rilevate utilizzando un nanosensore plasmonico, i ricercatori lo hanno usato per osservare i singoli ioni (atomi caricati elettricamente). "Siamo rimasti sorpresi che questo fosse possibile, " dice Vollmer. Gli ioni di zinco e mercurio che hanno usato hanno solo una dimensione di circa un decimo di nanometro, meno di un millesimo della lunghezza d'onda della luce utilizzata. È, però, possibile produrre un punto luminoso all'estremità di un nanorod in grado di sondare dimensioni così ridotte. "Non si tratta di identificare i singoli ioni, " sottolinea Vollmer. I ricercatori sono stati in grado di garantire che esattamente uno ione si attaccasse all'estremità del nanorod variando la concentrazione di ioni in soluzione. Scendere su questa scala potrebbe consentire ai biologi di studiare la funzione del canale ionico. I canali ionici includono, Per esempio, proteine incorporate nelle membrane delle cellule nervose responsabili della trasmissione del segnale lungo il nervo.
L'uso del nanosensore sviluppato dal team di Frank Vollmer non si limita alla visualizzazione di processi biochimici che coinvolgono enzimi e altre proteine. Può anche essere usato per osservare le reazioni chimiche tra le singole molecole e la superficie del nanorod d'oro. "Utilizzando questa tecnica, noi possiamo, Per esempio, rilevare e analizzare i meccanismi di interazione, " spiega Frank Vollmer. L'andamento temporale di queste interazioni può fornire informazioni su come diverse molecole si legano alla superficie del nanorod d'oro.
Per dimostrare questo, i ricercatori hanno studiato due tipi di molecole, uno contenente un gruppo amminico, uno contenente un gruppo tiolico. "Si scopre che i due gruppi reagiscono con la superficie dell'oro attraverso meccanismi diversi, " spiega Vollmer. Considerando che i gruppi amminici si legano agli atomi d'oro che sporgono dalla superficie, i gruppi tiolici si legano solo agli atomi incorporati completamente nella superficie.
Molecole esigenti:le molecole con gruppi amminici (rosa) si attaccano agli atomi d'oro che sporgono dalla superficie del nanorod. Al contrario, molecole con gruppi tiolici (blu) si attaccano agli atomi d'oro incorporati nella superficie. Se le molecole adsorbite reagiscono tra loro dipende dall'avere le giuste condizioni di reazione, (nello specifico pH, forza ionica e temperatura). Poiché la reazione è visibile nel segnale del sensore, il nanosensore plasmonico può essere utilizzato per ottimizzare rapidamente le reazioni di superficie. Credito:Frank Vollmer / Materiali avanzati
I ricercatori hanno anche osservato le reazioni tra le varie molecole. "Ciò consente ai chimici di testare e ottimizzare le condizioni di reazione in tempo reale, " dice Vollmer. L'uso di questo punto luminoso a nanobarre d'oro non si limita allo studio delle reazioni chimiche, tuttavia, può anche essere utilizzato per controllarli. Aumentando l'intensità della luce nel punto luminoso concentrato, i ricercatori hanno permesso a uno ione di mercurio di legarsi alla superficie del nanorod d'oro. L'intensità della luce nel punto luminoso aumenta l'energia degli elettroni nella bacchetta d'oro in modo che siano in grado di reagire con gli ioni di mercurio. Questo produce un amalgama stabile di oro e mercurio. I due elementi rimangono amalgamati anche quando il punto luce scompare, poiché la reazione produce un legame covalente relativamente stabile tra un atomo d'oro e un atomo di mercurio.
"Il controllo delle reazioni e dell'attività enzimatica sul biosensore plasmonico è un'area molto interessante per la ricerca futura, " afferma Vollmer. Il punto luminoso può essere utilizzato anche come pinzetta ottica per fissare temporaneamente singole biomolecole al sensore per l'analisi ottica.
Approfondimenti sui malfunzionamenti della macchina della vita
La visione futura del team di Vollmer è quella di essere in grado di scansionare molecole – sia biomolecole che molecole sintetiche – atomo per atomo. "Utilizzando diverse sorgenti luminose con diverse lunghezze d'onda e polarizzazioni, è in linea di principio possibile modificare il grado in cui la luce si sovrappone alla molecola e sondare diversi domini della stessa molecola, " spiega Vollmer. Uno scanner molecolare di questo tipo potrebbe essere in grado di osservare un processo da una varietà di angolazioni diverse e a intervalli molto brevi. Una mappa ad alta risoluzione di tale processo migliorerebbe significativamente la nostra comprensione del macchinario molecolare. I biologi potrebbero persino essere in grado di osservare in dettaglio come tali strutture cambiano in periodi che vanno da nanosecondi a diverse ore.Il biosensore plasmonico solleva anche la possibilità di un laboratorio automatizzato non più grande di un'unghia, che scansiona un campione, proteina per proteina, per diagnosticare la malattia a livello molecolare.
Se in futuro diventasse possibile utilizzare i nanosensori plasmonici per vedere come gli enzimi cambiano la loro forma, questo potrebbe consentire ai medici di comprendere meglio come i malfunzionamenti nel meccanismo della vita causino malattie come l'Alzheimer, che sono associati a cambiamenti nella struttura enzimatica. Una migliore comprensione di tali processi potrebbe persino fornire nuovi approcci al trattamento.
