La cristallografia macromolecolare (MX) a Diamond rivela la forma e la disposizione delle molecole biologiche a risoluzione atomica, la cui conoscenza fornisce una visione estremamente accurata della funzione. Credito:sorgente luminosa a diamante
Una nuova ricerca fa luce su come diverse specie batteriche possono costruire nano-arpioni complessi con diversi elementi costitutivi di proteine. I batteri usano questi arpioni chiamati sistemi di secrezione di tipo VI per iniettare tossine nelle cellule vicine. I ricercatori dell'Università di Sheffield hanno scoperto che mentre le proteine variavano, vi erano porzioni strutturalmente simili che interagivano con il macchinario.
I batteri producono nano-arpioni complessi sulla loro superficie cellulare. Una delle loro funzioni è quella di arpionare e iniettare tossine nelle cellule vicine. La produzione di un'arma così complessa richiede molti componenti mobili diversi che gli scienziati stanno ancora cercando di capire. I ricercatori dell'Università di Sheffield hanno utilizzato alcune delle linee di luce della cristallografia di Diamond per comprendere un pezzo particolarmente enigmatico di questo minuscolo puzzle. Il team guidato da David Rice e Mark Thomas ha lavorato su un componente proteico dell'arpione chiamato TssA che già sapevano essere parte integrante del macchinario.
Però, a differenza degli altri componenti dell'arpione, ci sono varianti distinte della proteina TssA che contengono sequenze di amminoacidi radicalmente diverse a un'estremità della proteina. Il team ha dimostrato che le strutture della regione variabile di due diverse subunità TssA erano completamente indipendenti e potevano assemblarsi in complessi multisubunità nettamente diversi in termini di dimensioni e geometria. Ciò ha sollevato la domanda su come batteri diversi potrebbero utilizzare questa proteina con strutture diverse per produrre un arpione con la stessa funzione in tutte le specie. Hanno scoperto che, nonostante queste differenze, c'era una regione conservata molto specifica all'altra estremità della proteina. Ipotizziamo che la regione conservata sia la parte che fa il lavoro e aiuta l'arpione a funzionare mentre la regione variabile funge da impalcatura. Hanno usato I02, I03 e I24 nel loro studio e pianificano di svolgere un lavoro di follow-up utilizzando cristallografia a raggi X e Cryo-EM come quelli presso il centro eBIC di Diamond. La ricerca è stata pubblicata su Comunicazioni sulla natura .
Nano-arpioni batterici e l'enigmatica proteina TssA
La guerra biologica nei batteri è relativamente ben nota. Un gruppo di batteri vuole annettersi una risorsa scarsa per sé, quindi producono una tossina a cui sono immuni e uccidono tutti i potenziali invasori. Però, alcuni batteri adottano un approccio più diretto. Invece di vomitare tossine nell'ambiente extracellulare, montano arpioni in miniatura sulla loro superficie più esterna e nuotano intorno iniettando tossine direttamente nei potenziali aggressori o concorrenti. Questa non è un'esagerazione o una metafora, in questo momento i batteri stanno nuotando letteralmente arpionandosi l'un l'altro fino alla morte. Questi arpioni sono chiamati sistemi di secrezione di tipo VI (T6SS) e dalla loro scoperta nel 2005, i ricercatori di tutto il mondo hanno cercato di capire questa impresa in miniatura dell'ingegneria.
La composizione e la complessità di queste macchine molecolari presentano problemi perfetti per la biologia strutturale e molti dei componenti proteici di queste macchine sono stati esaminati utilizzando la cristallografia a raggi X o la crio-microscopia elettronica. La ricerca ha dimostrato che l'intero sistema è costituito da un complesso proteico che forma una grande camera ancorata alla membrana. Questo contiene un tubo affilato che viene espulso non appena una guaina attorno ad esso si contrae contro una piastra di base proteica situata alla base della camera, sparare l'arpione contro un vicino ignaro.
Sebbene si capisca molto sui T6SS, ci sono ancora alcune componenti critiche che rimangono enigmatiche, uno di questi è la proteina TssA.
Uno dei microscopi crio-EM Titan Krios presso la struttura eBIC di Diamond, che potrebbe essere utilizzato per far avanzare questa ricerca. Credito:sorgente luminosa a diamante
Molti studi hanno dimostrato che questa proteina è parte integrante del macchinario T6SS, ma la ricerca sul DNA che codifica per questa proteina mostra che tra le specie, c'è molta variazione. La variazione non è normalmente desiderabile nelle proteine che hanno una funzione essenziale, se hai una ricetta che funziona, non è una buona idea cambiarne improvvisamente una parte significativa. Ciò ha sollevato alcune domande, cosa fa la proteina TssA e che effetto hanno queste variazioni sulla funzione?
Come funziona la proteina TssA?
Il team di ricerca ha iniziato facendo un'analisi della composizione amminoacidica di quattro diverse proteine TssA. Hanno scoperto che se mettevano le sequenze proteiche in una linea, il lato sinistro o N-terminale è sempre stato molto simile, e il lato destro o C-terminale variava molto. Il team si è chiesto se queste differenze avrebbero impedito alla proteina TssA di interagire come previsto con le altre proteine necessarie per costruire l'arpione batterico. Hanno eseguito test di laboratorio e hanno scoperto che in effetti, la proteina TssA ha interagito con quasi tutti gli altri componenti dell'arpione esattamente come previsto. Per capire perché, hanno fatto diversi viaggi a Diamond per usare l'I02, Linee di luce I03 e I24 per la cristallografia macromolecolare. Analizzando i dati delle diverse proteine TssA hanno scoperto che avevano strutture molto diverse. Ciò non ha influenzato solo l'aspetto delle singole proteine, ma anche il modo in cui hanno interagito tra loro per formare complessi multisubunità.
Il team di ricerca conosceva già una struttura pubblicata della proteina che si è formata in un anello a 6 membri una volta assemblata. Però, i loro nuovi studi hanno rivelato che diverse versioni della proteina TssA potrebbero formare anelli a 5 o 16 membri. Nonostante le differenze, tutte le proteine TssA avevano una porzione strutturalmente conservata che si trovava sempre all'esterno dei complessi di assemblaggio. Ciò ha portato il team di ricerca a ipotizzare che fosse questa sezione conservata ad essere coinvolta nel funzionamento dell'arpione batterico. Hanno ragionato sul fatto che il resto della proteina che conteneva tutta la variazione agiva come un'impalcatura per contenere l'unità di lavoro del complesso proteico.
Cosa riserva il futuro?
Sebbene le prove siano convincenti, c'è ancora molto lavoro da fare. Il professor David Rice ha affermato che "il futuro di questo lavoro è ottenere più esempi da diverse specie batteriche e combinare i dati della cristallografia con le tecniche Cryo-EM". In definitiva, il team vorrebbe studiare la struttura e la funzione dell'intero complesso T6SS di diversi batteri per verificare se la loro ipotesi è corretta. Hanno in programma di utilizzare la cristallografia a raggi X su linee di luce come I03, I24 così come il VMXi di nuova costruzione. Hanno anche in programma di utilizzare Cryo-EM, disponibile anche presso il centro eBIC di Diamond. La combinazione di queste tecniche complementari di biologia strutturale consentirà ai ricercatori di costruire un'immagine più completa di come è costruito questo complesso pezzo di nanomacchina e di come funziona.
Le tecniche utilizzate possono anche informare altri ricercatori con domande simili. Dati precedenti avevano suggerito che la proteina TssA fosse un omologo di una proteina della piastra base trovata nel batteriofago. Questo studio ha dimostrato che non solo non era così, ma che le proteine TssA erano molto diverse tra loro e avevano inizialmente portato gli scienziati ad assegnare erroneamente la funzione. Lavoro dettagliato sulle sequenze proteiche, studi di interazione e accurati esperimenti di biologia strutturale hanno permesso al team di ricerca di Sheffield di scoprire un quadro più accurato di questa importante arma microbica.
La ricerca è di grande interesse anche per chimici e ingegneri che possono trarre ispirazione dai batteri per produrre le proprie nanomacchine. Esistono potenziali applicazioni nel controllo delle infezioni in cui gli arpioni potrebbero essere presi di mira da nuovi farmaci per disabilitare i batteri che li impiegano quando causano infezioni. Esistono anche applicazioni nella somministrazione di farmaci in cui gli arpioni possono essere utilizzati per iniettare farmaci peptidici e proteici in cellule bersaglio specifiche. A un livello più fondamentale, semplicemente capire come può essere costruita una macchina in movimento così piccola e complessa e come funziona potrebbe un giorno aiutarci a costruire la nostra.
