Gli scienziati del Fred Hutchinson Cancer Research Center hanno fatto un passo avanti per rendere la terapia genica più pratica, semplificando il modo in cui le istruzioni di modifica genetica vengono fornite alle cellule. Usando una nanoparticella d'oro invece di un virus inattivato, hanno fornito in sicurezza strumenti di modifica genetica in modelli di laboratorio di HIV e malattie ereditarie del sangue, come riportato il 27 maggio in Materiali della natura .

È la prima volta che una nanoparticella d'oro caricata con CRISPR è stata utilizzata per modificare i geni in un raro ma potente sottoinsieme di cellule staminali del sangue, la fonte di tutte le cellule del sangue. La nanoparticella d'oro che trasporta CRISPR ha portato a un editing genetico di successo nelle cellule staminali del sangue senza effetti tossici.

"Man mano che le terapie geniche si fanno strada attraverso gli studi clinici e diventano disponibili per i pazienti, abbiamo bisogno di un approccio più pratico, " ha detto l'autore senior Dr. Jennifer Adair, un assistente membro della Divisione di ricerca clinica presso Fred Hutch, aggiungendo che gli attuali metodi per eseguire la terapia genica sono inaccessibili a milioni di persone in tutto il mondo. "Volevo trovare qualcosa di più semplice, qualcosa che fornisca passivamente l'editing genetico alle cellule staminali del sangue".

Mentre CRISPR ha reso più veloce e più facile fornire con precisione modifiche genetiche al genoma, ha ancora delle sfide. Far accettare alle cellule gli strumenti di modifica genetica CRISPR comporta una piccola scossa elettrica che può danneggiare e persino uccidere le cellule. E se sono necessarie modifiche genetiche precise, quindi ulteriori molecole devono essere progettate per consegnarle, aggiungendo costi e tempo.

Le nanoparticelle d'oro sono un'alternativa promettente perché la superficie di queste minuscole sfere (circa 1 miliardesimo delle dimensioni di un granello di sale da cucina) consente ad altre molecole di attaccarsi facilmente e rimanere aderenti.

"Abbiamo progettato le nanoparticelle d'oro per attraversare rapidamente la membrana cellulare, schivare gli organelli cellulari che cercano di distruggerli e andare dritti al nucleo cellulare per modificare i geni, " ha detto il dottor Reza Shahbazi, un ricercatore post-dottorato di Fred Hutch che ha lavorato con le nanoparticelle d'oro per la somministrazione di farmaci e geni per sette anni.

Shahbazi ha realizzato le particelle d'oro da oro di laboratorio che viene purificato e si presenta come un liquido in una piccola bottiglia da laboratorio. Ha mescolato l'oro purificato in una soluzione che fa sì che i singoli ioni d'oro formino minuscole particelle, che i ricercatori hanno poi misurato per le dimensioni. Hanno scoperto che una dimensione particolare, larga 19 nanometri, era la migliore per essere abbastanza grande e appiccicosa da aggiungere materiali di modifica genetica alla superficie delle particelle, pur essendo abbastanza piccoli da consentire alle cellule di assorbirli.

Impacchettato sulle particelle d'oro, il team di Fred Hutch ha aggiunto questi componenti di modifica genetica (schema disponibile):

• Un tipo di guida molecolare chiamata crRNA agisce come un GPS genetico per mostrare al complesso CRISPR dove nel genoma effettuare il taglio.
• proteina nucleasi CRISPR, spesso chiamate "forbici genetiche, " fa il taglio nel DNA. La proteina nucleasi CRISPR più usata è Cas9. Ma i ricercatori di Fred Hutch hanno studiato anche Cas12a (precedentemente chiamato Cpf1) perché Cas12a fa un taglio sfalsato nel DNA. I ricercatori speravano che questo avrebbe permesso alle cellule di riparare efficacemente il taglio e nel frattempo incorporare le nuove istruzioni genetiche nella cellula.Un altro vantaggio di Cas12a rispetto a Cas9 è che richiede solo una guida molecolare, che è importante a causa dei vincoli di spazio sulle nanoparticelle. Cas9 richiede due guide molecolari.
• Istruzioni su quali modifiche genetiche apportare ("ssDNA"). Il team di Fred Hutch ha scelto due cambiamenti genetici ereditati che conferiscono protezione dalle malattie:CCR5, che protegge dall'HIV, ed emoglobina gamma, che protegge da malattie del sangue come anemia falciforme e talassemia.
• Un rivestimento di una polietilenimmina sciama sulla superficie delle particelle per dare loro una carica più positiva, che consente loro di essere più facilmente assorbiti nelle cellule. Questo è un miglioramento rispetto a un altro metodo per far sì che le cellule utilizzino strumenti di editing genetico, chiamata elettroporazione, che comporta uno shock leggero delle cellule per farle aprire e consentire l'ingresso delle istruzioni genetiche.

Quindi i ricercatori hanno isolato le cellule staminali del sangue con un marcatore proteico sulla loro superficie chiamato CD34. Queste cellule CD34-positive contengono le cellule progenitrici che producono il sangue che danno origine all'intero sangue e al sistema immunitario.

"Queste cellule reintegrano il sangue nel corpo ogni giorno, rendendoli un buon candidato per la terapia genica una tantum perché durerà una vita mentre le cellule si sostituiscono, " disse Adair.

Osservando le cellule staminali del sangue umano in un piatto da laboratorio, i ricercatori hanno scoperto che le loro nanoparticelle d'oro a pieno carico sono state assorbite naturalmente dalle cellule entro sei ore dall'aggiunta e entro 24-48 ore potevano vedere l'editing genetico. Hanno osservato che il partner proteico Cas12a CRISPR era migliore nel fornire modifiche genetiche molto precise alle cellule rispetto al partner proteico cas9 più comunemente usato.

L'effetto di modifica del gene ha raggiunto un picco otto settimane dopo che i ricercatori hanno iniettato le cellule in modelli murini; 22 settimane dopo l'iniezione le cellule modificate erano ancora lì. I ricercatori di Fred Hutch hanno anche trovato cellule modificate nel midollo osseo, milza e timo dei modelli murini, un segno che le cellule del sangue in divisione in quegli organi potrebbero continuare il trattamento senza che i topi debbano essere trattati di nuovo.

"Riteniamo di avere un buon candidato per due malattie:HIV ed emoglobinopatie, anche se stiamo valutando anche altri bersagli di malattie in cui piccoli cambiamenti genetici possono avere un grande impatto, così come modi per apportare cambiamenti genetici più grandi, " Ha detto Adair. "Il passo successivo è aumentare la quantità di editing genetico che avviene in ogni cellula, che è sicuramente fattibile. Questo lo renderà più vicino ad essere una terapia efficace".

Nello studio, i ricercatori riferiscono che dal 10 al 20 percento delle cellule hanno subito le modifiche genetiche, che è un inizio promettente, ma i ricercatori vorrebbero puntare al 50% o più delle celle modificate, che ritengono avranno buone possibilità di combattere queste malattie.