I ricercatori dell'Università dell'Illinois hanno ottenuto i più alti tassi di inserimento di geni nelle cellule umane con il sistema di modifica genica CRISPR-Cas9, un passo necessario per sfruttare CRISPR per applicazioni di terapia genica clinica.

Modificando chimicamente le estremità del DNA da inserire, la nuova tecnica è fino a cinque volte più efficiente degli approcci attuali. I ricercatori hanno visto miglioramenti in varie località genetiche testate in una linea cellulare renale umana, anche vedendo un inserimento del 65% in un sito in cui il precedente massimo era stato del 15%.

Guidato dal professore di ingegneria chimica e biomolecolare Huimin Zhao, i ricercatori hanno pubblicato il loro lavoro sulla rivista Natura chimica biologia .

I ricercatori hanno scoperto che CRISPR è uno strumento efficiente per spegnere, o "knock out, "un gene. Tuttavia, nelle cellule umane, non è stato un modo molto efficiente per inserire o "buttare dentro" un gene.

"Un buon metodo knock-in è importante sia per le applicazioni di terapia genica che per la ricerca biologica di base per studiare la funzione genica, " disse Zhao, che guida il tema del design dei biosistemi presso il Carl R. Woese Institute for Genomic Biology in Illinois. "Con un metodo a colpo d'occhio, possiamo aggiungere un'etichetta a qualsiasi gene, studia la sua funzione e osserva come l'espressione genica è influenzata dal cancro o dai cambiamenti nella struttura cromosomica. O per applicazioni di terapia genica, se qualcuno ha una malattia causata da un gene mancante, vogliamo essere in grado di inserirlo."

Alla ricerca di un modo per aumentare l'efficienza, Il gruppo di Zhao ha esaminato 13 modi diversi per modificare il DNA inserito. Hanno scoperto che piccoli cambiamenti alla fine del DNA aumentavano sia la velocità che l'efficienza dell'inserimento.

Quindi, i ricercatori hanno testato l'inserimento di frammenti di DNA modificati alla fine di varie dimensioni in più punti del genoma, utilizzando CRISPR-Cas9 per mirare con precisione a siti specifici per l'inserimento. Hanno scoperto che l'efficienza è migliorata da due a cinque volte, anche quando si inseriscono frammenti di DNA più grandi, l'inserimento più difficile da realizzare.

"Ipotizziamo che l'efficienza sia migliorata così tanto perché la modifica chimica alla fine stabilizza il DNA che stiamo inserendo, " Disse Zhao. "Normalmente, quando provi a trasferire il DNA nella cellula, viene degradato da enzimi che lo divorano dalle estremità. Pensiamo che la nostra aggiunta chimica protegga le estremità. Più DNA sta entrando nel nucleo, e quel DNA è più stabile, ecco perché penso che abbia maggiori possibilità di essere integrato nel cromosoma".

Il gruppo di Zhao sta già utilizzando il metodo per etichettare i geni essenziali negli studi sulla funzione genica. Hanno usato di proposito sostanze chimiche standard per modificare i frammenti di DNA in modo che altri gruppi di ricerca potessero utilizzare lo stesso metodo per i propri studi genetici.

"In passato abbiamo sviluppato un bel po' di metodi knock-in, ma non abbiamo mai pensato di usare solo sostanze chimiche per aumentare la stabilità del DNA che vogliamo inserire, " Zhao ha detto. "È una strategia semplice, ma funziona".