L'elettroforesi su gel di poliacrilammide consente la separazione ad alta risoluzione delle proteine ​​estratte da campioni biologici, ma richiede più di un giorno di pretrattamento per recuperare le proteine ​​separate intrappolate all'interno del gel per il rilevamento mediante spettrometria di massa. BAC-DROP, la nostra nuova tecnologia di elettroforesi, utilizza una forma solubile di gel di poliacrilammide, che consente di completare il pretrattamento del campione in circa cinque ore. La tecnologia sviluppata consentirà la rapida diagnosi di virus e marcatori proteici della malattia.

La spettrometria di massa (MS) è un metodo potente per l'analisi dei biomarcatori perché consente una misurazione altamente sensibile e accurata delle molecole bersaglio nei campioni clinici. L'applicazione della SM alla diagnosi clinica, come lo screening metabolico neonatale, sta progredendo concentrandosi sui marcatori dei metaboliti. La misurazione MS delle proteine ​​è attualmente utilizzata principalmente per nuovi studi sulla scoperta di marcatori, ma c'è un crescente interesse per la sua applicazione nella diagnosi di marcatori clinici come alternativa ai test immunologici.

La quantificazione basata su MS dei biomarcatori proteici viene eseguita principalmente con un approccio dal basso verso l'alto utilizzando frammenti peptidici ottenuti dalla digestione enzimatica delle proteine ​​con tripsina. I protocolli di digestione standard richiedono un tempo di reazione superiore a 20 ore, che è un fattore limitante nei flussi di lavoro di preparazione dei campioni.

Sebbene la quantificazione delle proteine ​​mediante MS sia altamente sensibile, plasma e siero proteoma sono altamente complessi, e l'interferenza di altri componenti rappresenta una sfida significativa. Per il rilevamento ad alta precisione di marcatori target, sono stati segnalati approcci per la pre-rimozione dei principali componenti delle proteine ​​sieriche come l'albumina o l'arricchimento selettivo di marcatori target utilizzando colonne di anticorpi, ma l'effetto fuori bersaglio sui risultati quantitativi e la difficoltà di elaborare più campioni rimangono ostacoli.

In questo studio, ci siamo concentrati su gel di poliacrilammide solubili utilizzando N, N'-Bis(acriloil)cistamina (BAC) come reticolante per risolvere questi problemi. I gel di poliacrilammide reticolato BAC si dissolvono facilmente mediante trattamento di riduzione, consentendo il recupero delle proteine ​​sfuggite nella soluzione. Abbiamo scoperto che le proteine ​​recuperate erano adatte per la digestione rapida della tripsina in condizioni di alta temperatura, e siamo riusciti a stabilire un metodo di preparazione del campione ad alta produttività per la quantificazione di biomarcatori basati su MS, che abbiamo chiamato BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

Il frazionamento del proteoma ad alta risoluzione con BAC-DROP è particolarmente efficace per la quantificazione MS di proteine ​​marcatori traccia mirate derivate da campioni clinici. Introducendo BAC-DROP nel flusso di lavoro di quantificazione basato su MS della proteina C-reattiva del biomarcatore infiammatorio (CRP), siamo stati in grado di completare il pretrattamento del campione in sole 5 ore e di quantificare con successo la CRP da un campione di siero umano da 0,5 µl. Siamo anche riusciti a una diagnosi sierologica dell'infezione da virus dell'epatite B (HBV) mediante quantificazione dell'HBsAg combinata con BAC-DROP e MS. Recentemente, l'interesse per la diagnosi di SM delle infezioni virali è in rapido aumento, come esemplificato dalla diagnosi di COVID-19. L'approccio di preparazione del campione ad alto rendimento di BAC-DROP mostrato in questo studio sarà applicabile non solo all'HBV ma anche ad altri campioni di malattie virali infettive.