Credito:Università di Kumamoto
Le proteine che compongono le nostre cellule contengono un intero mondo di informazioni che, una volta sbloccate, possono darci informazioni sulle origini di molti fenomeni biologici essenziali. Queste informazioni vengono raccolte utilizzando una tecnica analitica nota come "proteomica unicellulare", in cui viene eseguita un'analisi unicellulare per osservare le caratteristiche delle singole cellule al loro livello proteico. Nel corso degli anni, gli scienziati hanno utilizzato la proteomica unicellulare nei campi della genomica del cancro, della differenziazione cellulare e dello sviluppo dei tessuti. Tuttavia, le attuali tecniche di proteomica soffrono di un basso tasso di recupero dei campioni proteici, di una bassa produttività e della mancanza di versatilità.
Fortunatamente, un team di ricercatori giapponesi e statunitensi guidati dal professore assistente Takeshi Masuda dell'Università di Kumamoto in Giappone ha trovato una soluzione a questi problemi. In un recente studio reso disponibile online l'11 luglio 2022 e pubblicato su Chimica analitica il 26 luglio 2022, il team ha introdotto un metodo di preparazione del campione semplice ma altamente efficiente per la proteomica unicellulare chiamato "metodo della goccia d'acqua nell'olio" (WinO). La tecnica utilizza l'immiscibilità dell'acqua con olio/solvente organico a proprio vantaggio per preparare campioni proteici con una perdita minima e maggiori possibilità di recupero del campione.
"Per rendere più efficiente la proteomica delle singole cellule, dobbiamo amplificare il campione proteico o assicurarci che non venga perso durante la preparazione del campione. Poiché non avevamo i mezzi per eseguire la prima, era fondamentale ridurre l'assorbimento perdite durante le fasi di preparazione del campione come il trasferimento del campione", spiega il dott. Masuda. "La tecnica WinO non solo riduce la perdita di campione attraverso l'adsorbimento, ma fornisce anche una migliore produttività rispetto ai metodi convenzionali."
Per il processo WinO, il team ha prima preparato un tampone di estrazione mescolando un microlitro di acqua con tensioattivi a trasferimento di fase (che aumentano la solubilità delle proteine idrofobiche) e perline nanomagnetiche idrofobiche rivestite di carbossile. Questa miscela è stata quindi gocciolata in 50 microlitri di acetato di etile.
Il passaggio successivo è stata l'estrazione delle proteine, che è stata eseguita aggiungendo goccioline cellulari dal selezionatore cellulare alla combinazione di goccioline d'acqua e acetato di etile e facendola girare in una centrifuga per consentire alla proteina di accumularsi all'interno della gocciolina d'acqua. Dopo l'estrazione, il campione è stato digerito utilizzando un enzima proteico, Lys-C, ed etichettato utilizzando un reagente "tag di massa tandem". Il campione estratto-digerito-etichettato è stato quindi purificato e recuperato per l'analisi unicellulare e i profili proteomici.
Per confrontare l'efficacia del metodo WinO con i metodi convenzionali, il team ha anche preparato campioni utilizzando il metodo di digestione in soluzione standard (ISD) e ha effettuato l'analisi proteomica. Hanno scoperto che il metodo WinO ha portato a un aumento di 10 volte del recupero di proteine e peptidi rispetto all'ISD. Questo notevole miglioramento è stato attribuito a una ridotta area di contatto tra la soluzione di estrazione e il contenitore del campione.
Per analizzare la sensibilità di entrambi i metodi, il team ha anche confrontato i profili proteomici ottenuti. Hanno osservato un'elevata correlazione tra i profili proteomici ottenuti per 100 cellule utilizzando WinO e quello per 10.000 cellule utilizzando ISD. Inoltre, il team ha quantificato con successo 462 proteine utilizzando WinO, dimostrando che forniva una produttività e un'efficienza di estrazione molto più elevate rispetto alle tecniche convenzionali.
La maggiore capacità di recupero e identificazione delle proteine fornita da WinO potrebbe consentire uno sguardo più da vicino all'espressione proteica delle cellule tumorali e una migliore comprensione dei meccanismi alla base della resistenza ai farmaci antitumorali. Inoltre, WinO può essere semiautomatico utilizzando un robot per la manipolazione dei liquidi, rendendolo adatto per l'elaborazione di campioni ad alta velocità e di grande capacità. "La nostra ricerca potrebbe consentire agli scienziati di eseguire la proteomica su quantità di campioni rari e limitati, oltre a fornire una nuova prospettiva sull'espressione delle proteine, aprendo possibilità per la scoperta di nuovi fenomeni biologici", conclude il dott. Masuda. + Esplora ulteriormente
