Un team internazionale di scienziati ha utilizzato per la prima volta un laser a raggi X a elettroni liberi per svelare la struttura di una particella virale intatta a livello atomico. Il metodo utilizzato riduce drasticamente la quantità di materiale virale necessaria, consentendo allo stesso tempo di svolgere le indagini più volte più velocemente di prima. Questo apre opportunità di ricerca completamente nuove, come riporta sulla rivista il gruppo di ricerca guidato dallo scienziato DESY Alke Meents Metodi della natura .

Nel campo noto come biologia strutturale, gli scienziati esaminano la struttura tridimensionale delle molecole biologiche per capire come funzionano. Questa conoscenza migliora la nostra comprensione dei processi biologici fondamentali che avvengono all'interno degli organismi, come il modo in cui le sostanze vengono trasportate dentro e fuori una cellula, e può essere utilizzato anche per sviluppare nuovi farmaci.

"Conoscere la struttura tridimensionale di una molecola come una proteina fornisce una visione approfondita del suo comportamento biologico, " spiega il co-autore David Stuart, Direttore delle scienze della vita presso l'impianto di sincrotrone Diamond Light Source nel Regno Unito e professore all'Università di Oxford. "Un esempio è come comprendere la struttura di una proteina che un virus usa per "agganciarsi" a una cellula potrebbe significare che siamo in grado di progettare una difesa per la cellula per rendere il virus incapace di attaccarla".

La cristallografia a raggi X è di gran lunga lo strumento più prolifico utilizzato dai biologi strutturali e ha già rivelato le strutture di migliaia di molecole biologiche. Vengono coltivati ​​minuscoli cristalli della proteina di interesse, e poi illuminato con raggi X ad alta energia. I cristalli diffrangono i raggi X in modi caratteristici in modo che i modelli di diffrazione risultanti possono essere utilizzati per dedurre la struttura spaziale del cristallo - e quindi dei suoi componenti - su scala atomica. Però, i cristalli proteici non sono neanche lontanamente stabili e robusti come i cristalli di sale, Per esempio. Sono difficili da coltivare, rimanendo spesso minuscolo, e sono facilmente danneggiati dai raggi X.

"I laser a raggi X hanno aperto una nuova strada verso la cristallografia proteica, perché i loro impulsi estremamente intensi possono essere utilizzati per analizzare anche cristalli estremamente piccoli che non produrrebbero un'immagine di diffrazione sufficientemente luminosa utilizzando altre sorgenti di raggi X, " aggiunge il coautore Armin Wagner di Diamond Light Source. Tuttavia, ciascuno di questi microcristalli può produrre solo una singola immagine di diffrazione prima che evapori a causa dell'impulso a raggi X. Per eseguire l'analisi strutturale, anche se, sono necessarie centinaia o addirittura migliaia di immagini di diffrazione. In tali esperimenti, gli scienziati quindi iniettano un getto liquido fine di cristalli proteici attraverso un laser a raggi X pulsato, che rilascia una rapida sequenza di raffiche estremamente brevi. Ogni volta che un impulso di raggi X colpisce un microcristallo, viene prodotta e registrata un'immagine di diffrazione.

Questo metodo ha molto successo ed è già stato utilizzato per determinare la struttura di oltre 80 biomolecole. Però, la maggior parte del materiale del campione viene sprecato. "Il tasso di successo è in genere inferiore al due per cento degli impulsi, così la maggior parte dei preziosi microcristalli finiscono inutilizzati nel contenitore di raccolta, "dice Mements, che ha sede presso il Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) di Amburgo, una collaborazione di DESY, l'Università di Amburgo e la società tedesca Max Planck. Il metodo standard richiede quindi in genere diverse ore di tempo di trasmissione e quantità significative di materiale campione.

Per utilizzare il tempo di trasmissione limitato e il prezioso materiale del campione in modo più efficiente, il team ha sviluppato un nuovo metodo. Gli scienziati utilizzano un chip micro-modellato contenente migliaia di minuscoli pori per trattenere i cristalli proteici. Il laser a raggi X scansiona quindi il chip linea per linea, e idealmente ciò consente di registrare un'immagine di diffrazione per ciascun impulso del laser.

Il team di ricerca ha testato il suo metodo su due diversi campioni di virus utilizzando il laser a raggi X LCLS presso lo SLAC National Accelerator Laboratory negli Stati Uniti, che produce 120 impulsi al secondo. Hanno caricato il loro portacampioni con una piccola quantità di microcristalli dell'enterovirus bovino 2 (BEV2), un virus che può causare aborti spontanei, nati morti, e infertilità nei bovini, e che è molto difficile da cristallizzare.

In questo esperimento, gli scienziati hanno raggiunto un tasso di successo - in cui il laser a raggi X ha mirato con successo al cristallo - fino al 9%. In soli 14 minuti avevano raccolto dati sufficienti per determinare la corretta struttura del virus - che era già nota da esperimenti su altre sorgenti di luce a raggi X - fino a una scala di 0,23 nanometri (milionesimi di millimetro).

"Al meglio delle nostre conoscenze, questa è la prima volta che la struttura atomica di una particella virale intatta è stata determinata utilizzando un laser a raggi X, " Meents sottolinea. "Mentre i metodi precedenti con altre sorgenti di luce a raggi X richiedevano cristalli con un volume totale di 3,5 nanolitri, siamo riusciti a utilizzare cristalli più di dieci volte più piccoli, con un volume totale di soli 0,23 nanolitri."

Questo esperimento è stato condotto a temperatura ambiente. Mentre il raffreddamento dei cristalli proteici li proteggerebbe in una certa misura dai danni delle radiazioni, questo non è generalmente fattibile quando si lavora con cristalli di virus estremamente sensibili. I cristalli di proteine ​​virali isolate possono, però, essere congelato, e in una seconda prova, i ricercatori hanno studiato la poliedrina della proteina virale che costituisce un corpo di occlusione virale fino a diverse migliaia di particelle virali di alcune specie. Le particelle virali utilizzano questi contenitori per proteggersi dagli influssi ambientali e sono quindi in grado di rimanere intatte per tempi molto più lunghi.

Per la seconda prova, lo scienziato ha caricato il chip con cristalli di poliedrina e li ha esaminati utilizzando il laser a raggi X mantenendo il chip a temperature inferiori a meno 180 gradi Celsius. Qui, gli scienziati hanno raggiunto un tasso di successo fino al 90%. In soli dieci minuti avevano registrato immagini di diffrazione più che sufficienti per determinare la struttura proteica entro 0,24 nanometri. "Per la struttura della poliedrina, abbiamo dovuto scansionare solo un singolo chip che è stato caricato con quattro microgrammi di cristalli proteici; cioè ordini di grandezza inferiori alla quantità che sarebbe normalmente necessaria, " spiega Mements.

"Il nostro approccio non solo riduce il tempo di raccolta dei dati e la quantità di campione necessaria, apre anche l'opportunità di analizzare interi virus utilizzando laser a raggi X, " Meents riassume. Gli scienziati ora vogliono aumentare la capacità del loro chip di un fattore dieci, dalle 22, 500 a circa 200, 000 micropori, e aumentare ulteriormente la velocità di scansione fino a mille campioni al secondo. Questo permetterebbe di sfruttare meglio le potenzialità del nuovo laser a elettroni liberi a raggi X europeo XFEL, che sta entrando in funzione nella regione di Amburgo e che sarà in grado di produrre fino a 27, 000 impulsi al secondo. Per di più, la prossima generazione di chip esporrà solo quei micropori che sono attualmente in fase di analisi, per evitare che i cristalli rimanenti vengano danneggiati dalla radiazione diffusa dal laser a raggi X.

Ricercatori dell'Università di Oxford, l'Università della Finlandia orientale, l'Istituto svizzero Paul Scherrer, anche il Lawrence Berkeley National Laboratory negli Stati Uniti e lo SLAC sono stati coinvolti nella ricerca. Gli scienziati del diamante hanno collaborato con il team di DESY, con gran parte dello sviluppo e dei test del chip con micro-modelli eseguiti sulle linee di luce I02 e I24 di Diamond.