Una tecnica di recente sviluppo nota come microscopia a fluorescenza a foglio leggero ha portato a molte scoperte biologiche consentendo ai ricercatori di creare immagini 3D di tessuti, anche embrioni di animali vivi, utilizzando tag fluorescenti. Ora, i ricercatori segnalano la capacità di aumentare la profondità di imaging della microscopia a fluorescenza a foglio di luce con l'uso di un fenomeno ottico noto come assorbimento a tre fotoni.

Nella rivista The Optical Society (OSA) Lettere di ottica , i ricercatori riferiscono in dettaglio come l'assorbimento a tre fotoni può essere utilizzato con la microscopia a fluorescenza a foglio di luce per ottenere immagini più profonde nei tessuti. A dimostrazione, hanno usato la tecnica combinata per produrre immagini chiare in una sfera di cellule coltivate, noto come sferoide, circa 450 micron di diametro.

"Questa dimostrazione è molto importante in quanto risponde a un'esigenza insoddisfatta di immagini migliori in profondità, che potrebbe aiutare gli scienziati a ottenere dati migliori sui processi biologici, " ha detto il capo del gruppo di ricerca, Kishan Dholakia dell'Università di St. Andrews nel Regno Unito "Questo approccio potrebbe essere particolarmente utile per le neuroscienze e gli studi di biologia dello sviluppo e potrebbe trovare applicazione nell'imaging di più campioni in modo automatizzato per la scoperta di farmaci".

La luce necessaria per l'immagine delle etichette fluorescenti può essere dannosa e persino mortale per campioni biologici delicati come il tessuto cerebrale o gli embrioni animali utilizzati per studiare lo sviluppo e i processi patologici. La microscopia a fluorescenza a foglio leggero consente una rapida, imaging ad alta risoluzione con pochi danni ottici perché illumina un campione con solo un sottile foglio di luce; altre parti del campione non ricevono alcuna esposizione alla luce non necessaria.

"Ci aspettiamo che la microscopia a fluorescenza a foglio di luce a tre fotoni abbia un grande impatto sull'imaging del cervello in roditori come topi e ratti, dove potrebbe essere utilizzato per catturare immagini a campo molto ampio con risoluzione subcellulare, ", ha detto il primo autore del giornale Adrià Escobet-Montalbán.

Immagini più profonde

I ricercatori volevano confrontare la microscopia a fluorescenza a foglio di luce a tre fotoni con l'assorbimento a due fotoni precedentemente utilizzato. Nell'assorbimento multifotonico, l'etichetta fluorescente emette luce dopo l'assorbimento, o essere eccitato da, due o tre fotoni invece del fotone utilizzato per produrre la fluorescenza tradizionale.

L'assorbimento multifotonico riduce la luce fuori fuoco e riduce al minimo la luce che potrebbe danneggiare il campione perché utilizza lunghezze d'onda più lunghe, che sono dispersi meno dal tessuto, e confinando la luce di eccitazione a un piccolo volume. Quando vengono utilizzati tre fotoni per produrre fluorescenza anziché due, questi benefici sono amplificati.

Per dimostrare la loro nuova tecnica, i ricercatori hanno utilizzato una configurazione ottica standard per la microscopia a fluorescenza a foglio di luce con un laser a impulsi che viene tradizionalmente utilizzato per l'eccitazione a due fotoni. Sebbene questo laser non fosse il più appropriato per creare un'eccitazione efficiente a tre fotoni, era ideale per confrontare l'eccitazione a due e tre fotoni.

Il team di ricerca ha ripreso sferoidi di cellule renali embrionali umane utilizzando l'eccitazione a due e tre fotoni. Vicino alla superficie dello sferoide, entrambe le modalità di imaging eseguite in modo simile. Però, al lato opposto dello sferoide, la qualità dell'immagine per la microscopia a fluorescenza a foglio di luce a tre fotoni ha preservato il contrasto dell'immagine mentre la qualità dell'immagine a due fotoni è diminuita considerevolmente.

Ottimizzazione della tecnica

Per migliorare ulteriormente l'imaging di profondità e il campo visivo, i ricercatori hanno sperimentato la modifica del profilo di intensità della luce del laser in un raggio Bessel, che ha un nucleo luminoso centrale circondato da anelli concentrici, piuttosto che il tradizionale raggio laser gaussiano solido come quello di un puntatore laser.

"I fasci di Bessel possono essere utilizzati in modalità foglio di luce a due fotoni, ma possono produrre potenziali artefatti a causa dei loro anelli concentrici, " ha affermato il co-autore Federico Gasparoli. "Per la prima volta, mostriamo numericamente e sperimentalmente che questi problemi sono soppressi nella microscopia a fluorescenza a foglio di luce a tre fotoni e che il raggio va ancora più in profondità, rendendo questo approccio molto attraente."

Prossimo, i ricercatori hanno in programma di migliorare la tecnica utilizzando sistemi laser a lunghezze d'onda più lunghe, progettati specificamente per l'assorbimento di tre fotoni. Ciò dovrebbe consentire l'imaging a maggiore profondità. In parallelo, i ricercatori stanno lavorando per sviluppare modi per rilevare la luce emessa dalle etichette fluorescenti in profondità all'interno dei campioni.