Gli scienziati dell'Università di Würzburg sono stati in grado di potenziare l'attuale microscopia a super-risoluzione con un nuovo ritocco. Hanno rivestito il vetrino coprioggetto come parte del supporto del campione con nanofogli biocompatibili su misura che creano un effetto specchio. Questo metodo mostra che la localizzazione di singoli emettitori davanti a un rivestimento dielettrico in metallo porta a una maggiore precisione, luminosità e contrasto in microscopia di localizzazione di singole molecole (SMLM). Lo studio è stato pubblicato su Natura rivista Luce:scienza e applicazioni .

La nitidezza di un microscopio ottico è limitata dalle condizioni fisiche:strutture più vicine tra loro di 0,2 millesimi di millimetro sfocate, e non possono più essere distinti l'uno dall'altro. La causa di questa sfocatura è la diffrazione. Ogni oggetto a forma di punto non viene quindi mostrato come un punto, ma come un punto sfocato.

Con metodi matematici, la risoluzione può ancora essere drasticamente migliorata. Un metodo calcola il suo centro esatto dalla distribuzione della luminosità del punto sfocato. Però, funziona solo se due punti strettamente adiacenti dell'oggetto sono inizialmente non simultaneamente ma successivamente visibili, e vengono uniti successivamente nell'elaborazione dell'immagine. Questo disaccoppiamento temporale impedisce la sovrapposizione del punto sfocato. Per anni, i ricercatori delle scienze della vita hanno utilizzato questo metodo complicato per la microscopia ottica delle cellule ad altissima risoluzione.

Uno di questi metodi è stato sviluppato dal gruppo di ricerca del Prof. Dr. Markus Sauer presso l'Università di Würzburg:microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM). Questa potente tecnica SMLM può fornire una risoluzione laterale di ~ 20 nm. Per questo scopo, determinate strutture, Per esempio, pori di un nucleo cellulare, sono colorati con coloranti fluorescenti. Ciascuna delle molecole di colorante lampeggia a intervalli irregolari e rappresenta parte del poro. L'immagine dei pori nucleari non è quindi inizialmente visibile, ma nasce dopo l'elaborazione dell'immagine dalla sovrapposizione di diverse migliaia di immagini. Con la tecnica dSTORM, la risoluzione di un microscopio ottico convenzionale può essere aumentata di un fattore 10. "Ci permette di visualizzare l'architettura di una cellula fino al suo livello molecolare, Per esempio, " spiega Hannah Heil. La ricercatrice sta svolgendo il suo dottorato presso il Centro Rudolf Virchow dell'Università di Würzburg nel gruppo della Prof.ssa Katrin Heinze.

Però, le statistiche dei fotoni definiscono un limite di risoluzione virtuale nella risoluzione. Per affrontare questo problema, Katrin Heinze ha avuto l'idea di utilizzare nanorivestimenti biocompatibili relativamente semplici per aumentare il segnale. In uno sforzo congiunto con Markus Sauer e colleghi della facoltà di Fisica, Hannah Heil ha progettato e fabbricato nanorivestimenti metallo-dielettrici che si comportano come uno specchio sintonizzabile. Quasi raddoppia la risoluzione.

Specchio, specchio sul muro:quale immagine è la più nitida di tutte?

Durante l'osservazione, hanno posizionato le cellule su un vetrino coprioggetto depositato a vapore con un sottile rivestimento nano riflettente costituito da argento e nitrito di silicio trasparente. Il rivestimento è biocompatibile, quindi non danneggia la cellula. Con questo metodo, i due gruppi hanno ottenuto due effetti:lo specchio rifletteva la luce emessa al microscopio, che ha aumentato la luminosità del segnale di fluorescenza e quindi anche l'effettiva nitidezza dell'immagine.

Secondo, le onde luminose emesse e riflesse si sovrappongono. Questo crea la cosiddetta interferenza. A seconda della distanza dallo specchio, la luce viene amplificata o attenuata. "In questo modo, vediamo principalmente le strutture in un certo piano dell'immagine, " dice Heil. "Tutto ciò che è sopra o sotto e potrebbe disturbare l'immagine è, d'altra parte, nascosto." Per garantire che le parti esatte dell'immagine diventino visibili, lo spessore dello strato trasparente applicato allo specchio deve essere scelto opportunamente. Tra l'altro, Heinze e Heil utilizzano simulazioni al computer per adattare il rivestimento in base all'oggetto.

Globale, il metodo è sorprendentemente facile da usare, dice Hannah Heil. "Questo è quello che mi piace davvero del nostro approccio." Il prof. Heinze aggiunge, "Fatta eccezione per l'economico coprioggetto rivestito in metallo dielettrico, non è necessario alcun hardware o software per microscopio aggiuntivo per aumentare la precisione di localizzazione, e quindi è un fantastico add-on nella microscopia avanzata."