I ricercatori della Rice University hanno creato un metodo per progettare maschere personalizzate che trasformano le immagini di microscopia fluorescente 2D in filmati 3D. Credito:Landes Research Group/Rice University
I ricercatori della Rice University hanno aggiunto una nuova dimensione alla loro tecnica innovativa che espande le capacità dei microscopi da laboratorio standard.
Due anni fa, il laboratorio Rice del chimico Christy Landes ha introdotto la microscopia a risoluzione super temporale, una tecnica che ha permesso ai ricercatori di acquisire immagini di molecole fluorescenti 20 volte più velocemente di quanto normalmente consentito dalle fotocamere da laboratorio tradizionali. Ora hanno sviluppato un metodo generale per consentire a un microscopio di acquisire informazioni spaziali 3D insieme alla quarta dimensione, movimento molecolare nel tempo.
Questo, dicono, aiuterà gli scienziati che studiano i processi dinamici a vedere dove si trovano le molecole di interesse e quanto velocemente si muovono, ad esempio, all'interno delle cellule viventi.
Il metodo Rice per espandere le capacità dei microscopi a fluorescenza ad ampio campo esistenti è dettagliato nel documento ad accesso aperto del team in Ottica Express .
Descrive la creazione di maschere di fase personalizzate:trasparenti, dischi rotanti che manipolano la fase della luce per cambiare la forma dell'immagine catturata dalla fotocamera del microscopio. La forma contiene informazioni sulla posizione 3D di una molecola nello spazio e su come si comporta nel tempo all'interno del campo visivo della telecamera.
Una maschera di fase trasforma quello che sembra un inconveniente, la macchia sfocata in un'immagine al microscopio, in un bene. Gli scienziati danno a questo blob un nome - funzione di diffusione del punto - e lo usano per ottenere dettagli sugli oggetti al di sotto del limite di diffrazione che sono più piccoli di quanto tutti i microscopi a luce visibile siano in grado di vedere.
Un'immagine al microscopio elettronico mostra una maschera di fase programmata da un algoritmo creato alla Rice University. La maschera personalizzabile consente al laboratorio Rice di acquisire immagini di molecole per determinarne la profondità e la velocità con cui si muovono, anche se sono più veloci di un singolo frame della fotocamera. Credito:Landes Research Group/Rice University
Il lavoro originale utilizzava una maschera di fase rotante che trasformava la luce da una singola molecola fluorescente in quella che i ricercatori chiamavano una doppia elica rotante. L'immagine catturata è apparsa sulla fotocamera come due dischi luminosi, come i lobi di un bilanciere. Nel nuovo lavoro, i bilancieri rotanti consentivano loro di vedere non solo dove si trovavano le molecole nello spazio tridimensionale, ma ha anche dato a ogni molecola un timestamp.
Il cuore del nuovo lavoro risiede negli algoritmi dell'autore principale e alunno di ingegneria elettrica e informatica di Rice Wenxiao Wang. Gli algoritmi rendono pratico progettare maschere di fase personalizzate che modificano la forma della funzione di diffusione del punto.
"Con la maschera di fase a doppia elica, le informazioni temporali e spaziali erano collegate, " ha detto il co-autore Chayan Dutta, un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Landes. "La rotazione dei lobi potrebbe esprimere informazioni sullo spazio 3-D o sul tempo veloce, e non c'era modo di dire la differenza tra tempo e spazio."
Maschere di fase migliori risolvono questo problema, Egli ha detto. "Il nuovo design della maschera di fase, che chiamiamo maschera di fase del lobo di stiramento, disaccoppia spazio e tempo, " disse Dutta. "Quando i bersagli sono a profondità diverse, i lobi si allargano o si avvicinano, e le informazioni sull'ora sono ora codificate solo nella rotazione."
Il trucco consiste nel manipolare la luce nella maschera della fase di rotazione per ottimizzare il modello per diverse profondità. Ciò è ottenuto dal pattern rifrattivo programmato nella maschera dall'algoritmo. "Ogni strato è ottimizzato nell'algoritmo per diverse profondità di rilevamento, " ha detto lo studente laureato e co-autore Nicholas Moringo. "Dove prima, potremmo vedere oggetti in due dimensioni nel tempo, ora possiamo vedere tutte e tre le dimensioni spaziali e il comportamento del tempo veloce contemporaneamente".
Le funzioni di diffusione puntuale delle singole molecole, catturati come doppi lobi attraverso una maschera di fase (a sinistra), può dire ai ricercatori dove si trova la molecola nello spazio 3D. La distanza tra i lobi dà loro la profondità della molecola. Credito:Landes Research Group/Rice University
"I microscopi a fluorescenza ad ampio campo sono utilizzati in molti campi, in particolare biologia cellulare e imaging medico, "Stiamo appena iniziando a dimostrare come la manipolazione della fase della luce all'interno di un microscopio sia un modo ragionevolmente semplice per migliorare la risoluzione spaziale e temporale rispetto allo sviluppo di nuovi tag fluorescenti o alla progettazione di nuovi miglioramenti hardware".
Un risultato importante che potrebbe avere un ampio appeal, lei disse, è che i ricercatori hanno generalizzato il design della maschera di fase in modo che i ricercatori possano fabbricare maschere per creare praticamente qualsiasi modello arbitrario. Dimostrare, il gruppo ha progettato e fabbricato una maschera per creare una complessa funzione di diffusione del punto che spiega RICE a diverse profondità focali. Un video mostra le lettere spettrali che appaiono e scompaiono mentre il microscopio si sposta a diverse profondità sopra e sotto il piano focale.
Tale flessibilità sarà utile per applicazioni come l'analisi dei processi all'interno delle cellule cancerose viventi, un progetto che il laboratorio spera di portare avanti presto con i partner del Texas Medical Center.
"Se hai una cella su un vetrino, sarai in grado di capire dove gli oggetti nella cella sono in relazione tra loro e quanto velocemente si muovono, " ha detto Moringo. "Le telecamere non sono abbastanza veloci da catturare tutto ciò che accade in una cella, ma il nostro sistema può."
