Gli scienziati dell'EPFL hanno sviluppato immagini multicolori a super risoluzione robuste e facili da implementare. L'approccio si basa sull'acquisizione simultanea di due canali spettrali seguita dall'analisi spettrale incrociata e dall'unmixing. Sfruttano il lampeggiamento del fluoroforo e la diafonia spettrale per la generazione di canali colore aggiuntivi con immagini super-risolte.

La microscopia a fluorescenza multicolore è uno strumento importante per le scienze della vita per studiare le disposizioni relative delle strutture cellulari o le interazioni di diverse proteine. Però, microscopi convenzionali, i cavalli di battaglia per molti studi biologici, può solo risolvere dettagli sull'ordine della lunghezza d'onda della luce. Negli ultimi due decenni, diversi concetti di microscopia a super risoluzione hanno aiutato i ricercatori a superare questo limite di diffrazione ea fare nuove scoperte. Questi nuovi metodi stanno solo lentamente trovando la loro strada nelle applicazioni biologiche di routine. Per alcune delle nuove tecniche, questo è dovuto al complesso hardware del microscopio, ma anche le crescenti richieste di preparazione del campione e le etichette fluorescenti pongono ostacoli significativi. I requisiti per un imaging ad alta risoluzione di successo sono ancora più difficili da soddisfare per le applicazioni multicolori.

Il laboratorio di ottica biomedica dell'EPFL, guidato da Theo Lasser, ha lavorato a lungo sull'imaging a fluttuazione ottica a super-risoluzione (SOFI) per aumentare la risoluzione spaziale e il campionamento in 2-D e 3-D. SOFI è un'alternativa alle tecniche di microscopia di localizzazione a singola molecola come STORM e PALM. Analizza statistiche spazio-temporali di ordine superiore di una serie temporale di fluorofori lampeggianti e non richiede l'isolamento delle singole emissioni di fluorofori. SOFI è compatibile con una gamma più ampia di condizioni di etichettatura e imaging, che semplifica la selezione e gli esperimenti dei fluorofori. Nel loro nuovo studio, i ricercatori della School of Engineering guidati da Theo Lasser e Aleksandra Radenovic (responsabile del Laboratorio di Biologia su nanoscala) hanno esteso l'analisi statistica al dominio spettrale per aprire la strada a un nuovo approccio per l'imaging a super risoluzione multicolore.

Il numero di colori non è limitato dai canali spettrali del microscopio o dallo sfruttamento della diafonia spettrale

L'idea alla base dell'approccio SOFI multicolore è la seguente. Nell'imaging multicolore classico dovrebbe essere evitato il crosstalk tra i diversi canali spettrali del microscopio. Qui, i ricercatori sfruttano la diafonia per generare ulteriori canali di colore. Applicano l'analisi del cumulo incrociato tra più canali spettrali acquisiti contemporaneamente. L'analisi statistica consente loro di integrare i canali di rilevamento fisici forniti dal microscopio con ulteriori canali spettrali virtuali. "Solo i segnali che sono spazialmente e temporalmente correlati nei diversi canali spettrali appariranno nei canali virtuali. Stiamo rilevando esattamente la diafonia di cui tutti gli altri vogliono sbarazzarsi". spiega Kristin Grußmayer, uno dei principali autori dello studio. I canali spettrali aggiuntivi generati computazionalmente insieme all'unmixing lineare consentono l'imaging di colori fluorofori più distinti rispetto ai canali di rilevamento fisico registrati.

La pubblicazione fornisce la teoria alla base del SOFI multicolore a cumulo incrociato spettrale e include un framework per ottimizzare i canali spettrali del microscopio per una data combinazione di fluorofori che devono essere ripresi. I set di dati simulati hanno aiutato il team a verificare che il loro nuovo approccio multicolore dovrebbe funzionare per un'ampia gamma di etichette con diverse proprietà fotofisiche, anche per quelli con spettri di emissione fortemente sovrapposti. "Potremmo dimostrare che il nostro approccio funziona per l'imaging a tre colori in cellule fisse e in cellule viventi per una varietà di coloranti e proteine ​​fluorescenti. L'imaging può essere eseguito utilizzando configurazioni widefield commerciali con unità di divisione dell'immagine a due canali che sono ampiamente disponibili. In linea di principio , non siamo limitati a 3 colori", afferma Kristin Grußmayer.

Le istruzioni per l'esecuzione di analisi SOFI multicolori spettrali cross-cumulanti sono disponibili sulla pagina web del Laboratorio di biologia su nanoscala all'indirizzo www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ e il pacchetto software può essere scaricato all'indirizzo www.epfl.ch/ labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip .