Un importante sforzo di collaborazione che si è sviluppato negli ultimi tre anni tra ASU e scienziati europei, ha portato a un significativo progresso tecnico nelle strategie di campionamento cristallografico a raggi X.

Il contributo ASU arriva dalla Scuola di Scienze Molecolari (SMS), dipartimento di fisica e il Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

Il laser europeo a raggi X a elettroni liberi (EuXFEL) è una struttura di ricerca di superlativi:genera impulsi a raggi X ultracorti:27, 000 volte al secondo e con una brillantezza un miliardo di volte superiore a quella delle migliori sorgenti di raggi X convenzionali. Dopo dieci anni di costruzione, ha aperto per i primi esperimenti alla fine del 2017. Il gruppo di Alexandra Ros, Il professore dell'SMS dell'ASU si è aggiudicato la seconda ripartizione del tempo del fascio tra i concorrenti mondiali.

I loro risultati, pubblicato il 9 settembre in Comunicazioni sulla natura , ha convalidato un generatore di goccioline microfluidico unico per ridurre le dimensioni del campione e gli sprechi (che possono arrivare fino al 99 percento) negli esperimenti di cristallografia seriale a femtosecondi (SFX) del suo team. Usando questo, hanno determinato la struttura cristallina dell'enzima 3-Deossi-d-manno-Octulosonate 8-Phosphate Synthase (KDO8PS) e hanno rivelato nuovi dettagli in una regione dell'ansa precedentemente indefinita dell'enzima che è un potenziale bersaglio per gli studi sugli antibiotici.

"Siamo entusiasti che questo lavoro, frutto di un enorme sforzo di collaborazione, è stato ben accolto nella comunità XFEL, " ha spiegato Ros. "Stiamo sviluppando ulteriormente questo metodo e stiamo cercando la sincronizzazione delle goccioline microfluidica con gli impulsi degli XFEL. In questo momento, un piccolo team di studenti dell'ASU ha appena terminato di eseguire esperimenti presso la Linac Coherent Light Source (LCLS) presso lo SLAC National Accelerator Laboratory a Menlo Park, CA per perfezionare il metodo. Non poteva esserci tempismo migliore per la pubblicazione del nostro lavoro".

SLAC è stata la struttura XFEL più nota agli scienziati statunitensi dove è stato svolto l'ormai famoso lavoro sulla cristallografia dei nanocristalli proteici (dal team dell'ASU guidato dai professori John Spence e Petra Fromme). SLAC e il suo compagno in Europa, anche ad Amburgo, hanno avuto molto successo e, di conseguenza, sono diventati pesantemente in overbooking. Il coming-on della nuova struttura, con il suo gigantesco tunnel acceleratore di 2,6 miglia e la risoluzione su scala di lunghezza atomica, ha alleviato parte della domanda sulle altre strutture, mentre offre grandi nuove possibilità nelle scienze fisiche.

SFX è una tecnica promettente per la determinazione della struttura delle proteine, dove un flusso liquido contenente cristalli proteici viene intersecato con un raggio XFEL ad alta intensità che è un miliardo di volte più luminoso delle tradizionali sorgenti di raggi X di sincrotrone.

Sebbene i cristalli vengano distrutti dall'intenso raggio XFEL subito dopo la diffrazione, le informazioni di diffrazione possono, notevolmente, comunque essere registrato grazie ai rilevatori di ultima generazione. Sono stati sviluppati nuovi potenti metodi di analisi dei dati, consentendo a un team di analizzare questi modelli di diffrazione e ottenere mappe di densità elettronica e informazioni strutturali dettagliate delle proteine.

Il metodo è particolarmente interessante per le proteine ​​difficili da cristallizzare, come proteine ​​di membrana, poiché fornisce informazioni strutturali ad alta risoluzione da micro e persino nanocristalli, riducendo così il contributo dei difetti cristallini ed evitando la noiosa (se non impossibile) crescita dei grandi cristalli richiesta dalla cristallografia tradizionale a base di sincrotrone.

Sebbene la cristallografia con XFEL sia stata una tecnica potente per svelare le strutture di grandi complessi proteici e anche per consentire la cristallografia risolta nel tempo, questa scienza all'avanguardia genera tuttavia un grosso problema. A causa del piccolo tasso di "colpi" richiede enormi quantità di proteine ​​sospese, che pur non essendo irradiato, sono ingombranti da recuperare per la maggior parte dei campioni di proteine. Fino al 99% delle proteine ​​può essere sprecato.

Qui sta il principale progresso tecnico fatto da Ros e dal suo team. Hanno sviluppato un dispositivo microfluidico stampato in 3D, che è ad alta risoluzione, e genera goccioline acquose in olio di segmentazione variabile delle goccioline che possono essere sincronizzate con gli impulsi laser a elettroni liberi. Ciò riduce drasticamente la quantità di proteina purificata necessaria per l'esperimento europeo XFEL dal requisito attualmente tipico (e quasi inaccessibile) di 1 g per la registrazione completa del set di dati.

L'importanza di questo sviluppo va ribadita. L'approccio dei ricercatori interfoglia "lumache" liquide cariche di campioni all'interno di un liquido sacrificale, in modo che venga mantenuto un microgetto liquido in rapido movimento con il campione presente solo durante l'esposizione agli impulsi XFEL a femtosecondi (un milionesimo di miliardesimo di secondo di durata).

Il team di scienziati ha dimostrato la generazione di goccioline delle sospensioni di cristalli dell'enzima KDO8PS con il generatore di goccioline microfluidico e ha dimostrato che la frequenza di generazione delle goccioline può essere controllata dalle velocità dei flussi acquosi e oleosi. La qualità di diffrazione dei cristalli di KDO8PS è simile sia quando iniettati in goccioline acquose circondate da olio o per iniezione continua con un Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), con una riduzione del ~60% del consumo di campione ottenuta con l'iniezione di goccioline.

La struttura determinata ha rivelato nuovi dettagli in una regione di loop precedentemente indefinita di KDO8PS, un potenziale bersaglio per gli studi sugli antibiotici. Questi risultati sostengono la futura integrazione di routine della generazione di goccioline mediante flusso di olio segmentato in altri XFEL in tutto il mondo.