Il team polacco-israeliano della Facoltà di Fisica dell'Università di Varsavia e del Weizmann Institute of Science ha ottenuto un altro risultato significativo nella microscopia a fluorescenza. Nelle pagine del ottica journal il team ha presentato un nuovo metodo di microscopia che, in teoria, non ha limiti di risoluzione. In pratica, il team è riuscito a dimostrare un miglioramento di quattro volte rispetto al limite di diffrazione.

Il continuo sviluppo delle scienze biologiche e della medicina richiede la capacità di esaminare oggetti sempre più piccoli. Gli scienziati devono vedere nella struttura di, e le reciproche relazioni tra, Per esempio, proteine ​​nelle cellule. Allo stesso tempo, i campioni osservati non devono differire dalle strutture presenti in natura negli organismi biologici, che esclude l'uso di procedure e reagenti aggressivi. Sebbene abbia rivoluzionato le scienze naturali, il microscopio ottico classico è oggi chiaramente insufficiente. A causa della natura ondulatoria della luce, un microscopio ottico non consente l'acquisizione di immagini di strutture inferiori a circa 250 nanometri. Di conseguenza, gli oggetti più vicini l'uno all'altro della metà della lunghezza d'onda della luce (che è circa 250 nm per la luce verde) non possono essere individuati. Questo fenomeno, noto come limite di diffrazione, uno dei principali ostacoli all'osservazione delle più piccole strutture biologiche, gli scienziati hanno a lungo tentato di superare. I microscopi elettronici forniscono una risoluzione migliore di ordini di grandezza, ma consentono solo l'esame di oggetti inanimati, che deve essere posto nel vuoto e bombardato da un fascio di elettroni. Per questa ragione, la microscopia elettronica non può essere utilizzata per studiare gli organismi viventi ei processi naturali che avvengono in essi. È qui che entra in gioco la microscopia a fluorescenza, da qui il rapido sviluppo della microscopia a fluorescenza a super risoluzione come campo delle scienze fisiche e i due premi Nobel già assegnati per la ricerca correlata, nel 2008 e nel 2014.

Oggigiorno sono disponibili diverse tecniche di microscopia a fluorescenza, e alcuni di essi si sono diffusi nell'imaging biologico. Alcuni metodi, come PALMA, Microscopia STORM o STED, sono caratterizzati da una risoluzione ultra elevata e consentono di distinguere oggetti situati a una dozzina di nanometri l'uno dall'altro. Però, queste tecniche richiedono lunghi tempi di esposizione e una complessa procedura di preparazione dei campioni biologici. Altre tecniche, come microscopia SIM o ISM, sono facili da usare, ma offrono un miglioramento della risoluzione molto limitato, permettendo di identificare strutture solo la metà della dimensione del limite di diffrazione.

Aleksandra Sroda, Adrian Makowski e il Dr. Radek Lapkiewicz del Quantum Optics Lab presso la Facoltà di Fisica dell'Università di Varsavia, in collaborazione con il dottor Ron Tenne, Uri Rossman, Gur Lubin e il Prof. Dan Oron del Weizmann Institute of Science in Israele, hanno introdotto una nuova tecnica di microscopia a super risoluzione, chiamata microscopia a scansione di immagini a fluttuazione ottica a super risoluzione (SOFISM). In SOFISMO, le fluttuazioni naturali dell'intensità di emissione dei marcatori fluorescenti vengono utilizzate per migliorare ulteriormente la risoluzione spaziale di un microscopio a scansione di immagini (ISM). ISM, un metodo emergente di super-risoluzione, è già stato implementato in prodotti commerciali e si è dimostrato prezioso per la comunità del bio-imaging. In gran parte, poiché ottiene un modesto miglioramento della risoluzione laterale (x2), con pochissime modifiche al setup ottico e senza il comune handicap dei lunghi tempi di posa. Così, consente un'estensione naturale delle capacità di un microscopio confocale standard. ISM utilizza un microscopio confocale in cui un singolo rivelatore viene sostituito con un array di rivelatori. In SOFISM vengono calcolate le correlazioni delle intensità rilevate da più rivelatori. In linea di principio, la misura della correlazione di ordine n-esimo può portare ad un fattore di miglioramento della risoluzione di 2n rispetto al limite di diffrazione. In pratica, la risoluzione ottenibile per correlazioni di ordine superiore è limitata dal rapporto segnale-rumore delle misurazioni.

"SOFISM è un compromesso tra facilità d'uso e risoluzione. Crediamo che il nostro metodo riempirà la nicchia tra il complesso, tecniche difficili da usare che forniscono una risoluzione molto elevata e metodi a bassa risoluzione di facile utilizzo. SOFISM non ha un limite teorico di risoluzione, e nel nostro articolo, dimostriamo risultati che sono quattro volte migliori del limite di diffrazione. Mostriamo anche che il metodo SOFISM ha un alto potenziale nell'imaging di strutture biologiche tridimensionali, " ha detto il dottor Radek Lapkiewicz.

In modo cruciale, SOFISMO è, nei suoi aspetti tecnici, altamente accessibile, poiché richiede solo l'introduzione di una piccola modifica al microscopio confocale ampiamente utilizzato, sostituendo il tubo fotomoltiplicatore con un rivelatore a matrice SPAD. Inoltre, è necessario aumentare leggermente il tempo di misurazione e modificare la procedura di elaborazione dei dati. "Fino a poco tempo fa, I rivelatori di array SPAD erano costosi e le loro specifiche non erano sufficienti per la microscopia basata sulla correlazione. Questa situazione è recentemente cambiata. I nuovi rilevatori SPAD introdotti lo scorso anno hanno rimosso sia le barriere tecnologiche che quelle legate al prezzo. Questo ci fa pensare che tecniche di microscopia a fluorescenza come SOFISM potrebbero, tra qualche anno, ampiamente utilizzato nel campo dell'esame microscopico, " ha sottolineato il dottor Lapkiewicz.