Tecniche microscopiche non invasive come la microscopia a coerenza ottica e la microscopia a due fotoni sono comunemente utilizzate per l'imaging in vivo di tessuti viventi. Quando la luce passa attraverso materiali torbidi come i tessuti biologici, vengono generati due tipi di luce:i fotoni balistici e i fotoni moltiplicati. I fotoni balistici viaggiano dritti attraverso l'oggetto senza subire alcuna deflessione e quindi vengono utilizzati per ricostruire l'immagine dell'oggetto. D'altra parte, i fotoni moltiplicati sono generati tramite deviazioni casuali mentre la luce passa attraverso il materiale e si manifestano come rumore di macchie nell'immagine ricostruita. Man mano che la luce si propaga per distanze crescenti, il rapporto tra fotoni multipli diffusi e balistici aumenta drasticamente, oscurando così le informazioni sull'immagine. Oltre al rumore generato dalla luce diffusa, l'aberrazione ottica della luce balistica provoca anche riduzione del contrasto e sfocatura dell'immagine durante il processo di ricostruzione dell'immagine.

I tessuti ossei in particolare hanno numerose strutture interne complesse, che causano gravi dispersioni multiple di luce e aberrazioni ottiche complesse. Quando si tratta di imaging ottico del cervello di topo attraverso un cranio intatto, le strutture fini del sistema nervoso sono difficili da visualizzare a causa del forte rumore di macchie e della distorsione dell'immagine. Questo è problematico nella ricerca neuroscientifica, dove il topo è ampiamente utilizzato come organismo modello. A causa della limitazione delle tecniche di imaging attualmente utilizzate, il cranio deve essere rimosso o assottigliato per indagare al microscopio le reti neurali dei tessuti cerebrali sottostanti.

Quindi sono state suggerite altre soluzioni per ottenere immagini più profonde dei tessuti viventi. Per esempio, Negli ultimi anni la microscopia a tre fotoni è stata utilizzata con successo per visualizzare i neuroni sotto il cranio del topo. Però, la microscopia a tre fotoni è limitata da una bassa frequenza di ripetizione del laser poiché impiega una finestra di eccitazione nella gamma dell'infrarosso, che possono danneggiare i tessuti viventi durante l'imaging in vivo. Ha anche un potere di eccitazione eccessivo, il che significa che il photobleaching è più esteso rispetto all'approccio a due fotoni.

Recentemente, un team di ricerca guidato dal Prof. Choi Wonshik presso il Center for Molecular Spectroscopy and Dynamics all'interno dell'Institute of Basic Science (IBS) di Seoul, La Corea del Sud ha compiuto un importante passo avanti nell'imaging ottico dei tessuti profondi. Hanno sviluppato un nuovo microscopio ottico in grado di visualizzare attraverso un cranio di topo intatto e acquisire una mappa microscopica delle reti neurali nei tessuti cerebrali senza perdere la risoluzione spaziale.

Questo nuovo microscopio è chiamato "microscopio a matrice di riflessione, ' e combina i poteri dell'hardware e dell'ottica adattiva computazionale (AO), che è una tecnologia originariamente sviluppata per l'astronomia terrestre per correggere le aberrazioni ottiche. Mentre un microscopio confocale convenzionale misura il segnale riflesso solo nel punto focale dell'illuminazione e scarta tutta la luce fuori fuoco, il microscopio a matrice di riflessione registra tutti i fotoni sparsi in posizioni diverse dal punto focale. I fotoni dispersi vengono quindi corretti computazionalmente utilizzando un nuovo algoritmo AO chiamato accumulazione ad anello chiuso di diffusione singola (CLASS), che il team ha sviluppato nel 2017. L'algoritmo sfrutta tutta la luce diffusa per estrarre selettivamente la luce balistica e correggere una grave aberrazione ottica. Rispetto alla maggior parte dei sistemi di microscopia AO convenzionali, che richiedono riflettori puntiformi luminosi o oggetti fluorescenti come stelle guida in modo simile all'uso di AO in astronomia, il microscopio a matrice di riflessione funziona senza alcuna etichettatura fluorescente e senza dipendere dalle strutture del bersaglio. Inoltre, il numero di modalità di aberrazione che possono essere corrette è più di 10 volte maggiore di quello dei sistemi AO convenzionali.

Il microscopio a matrice di riflessione ha un grande vantaggio in quanto può essere direttamente combinato con un microscopio convenzionale a due fotoni che è già ampiamente utilizzato nel campo delle scienze della vita. Per rimuovere l'aberrazione sperimentata dal raggio di eccitazione del microscopio a due fotoni, il team ha implementato un'ottica adattiva basata su hardware all'interno del microscopio a matrice di riflessione per contrastare l'aberrazione del cranio del topo. Hanno mostrato le capacità del nuovo microscopio prendendo immagini a fluorescenza a due fotoni di una spina dendritica di un neurone dietro il cranio di un topo, con una risoluzione spaziale prossima al limite di diffrazione. Normalmente un microscopio convenzionale a due fotoni non può risolvere la delicata struttura della colonna vertebrale dendrite senza rimuovere completamente il tessuto cerebrale dal cranio. Si tratta di un traguardo molto significativo, come il gruppo sudcoreano ha dimostrato la prima rappresentazione ad alta risoluzione di reti neurali attraverso un cranio di topo intatto. Ciò significa che ora è possibile studiare il cervello del topo nei suoi stati più nativi.

Il professore di ricerca Yoon Seokchan e lo studente laureato Lee Hojun, che ha condotto lo studio, disse, "Correggendo la distorsione del fronte d'onda, possiamo concentrare l'energia luminosa nella posizione desiderata all'interno del tessuto vivente... Il nostro microscopio ci consente di indagare le strutture interne fini in profondità all'interno dei tessuti viventi che non possono essere risolte in nessun altro modo. Questo ci aiuterà molto nella diagnosi precoce delle malattie e accelererà la ricerca neuroscientifica".

I ricercatori hanno impostato la loro prossima direzione di ricerca per ridurre al minimo il fattore di forma del microscopio e aumentare la sua velocità di imaging. L'obiettivo è lo sviluppo di un microscopio a matrice riflettente privo di etichette con un'elevata profondità di imaging per l'uso nelle cliniche.

Il vicedirettore Choi Wonshik ha dichiarato:"Il microscopio a matrice di riflessione è la tecnologia di nuova generazione che va oltre i limiti dei microscopi ottici convenzionali. Ciò ci consentirà di ampliare la nostra comprensione della propagazione della luce attraverso i mezzi di diffusione e di espandere l'ambito delle applicazioni che un microscopio ottico può esplorare".