I ricercatori hanno sviluppato una nuova tecnica di microscopia in grado di acquisire immagini in super-risoluzione 3D di strutture subcellulari da circa 100 micron di profondità all'interno del tessuto biologico, compreso il cervello. Dando agli scienziati una visione più profonda del cervello, il metodo potrebbe aiutare a rivelare sottili cambiamenti che si verificano nei neuroni nel tempo, durante l'apprendimento, o come conseguenza di una malattia.

Il nuovo approccio è un'estensione della microscopia a riduzione delle emissioni stimolate (STED), una tecnica rivoluzionaria che raggiunge la risoluzione su scala nanometrica superando il tradizionale limite di diffrazione dei microscopi ottici. Stefan Hell ha vinto il Premio Nobel per la Chimica 2014 per lo sviluppo di questa tecnica di imaging a super risoluzione.

In ottica , i ricercatori descrivono come hanno usato il loro nuovo microscopio STED per fotografare, in super risoluzione, la struttura 3-D delle spine dendritiche nel profondo del cervello di un topo vivente. Le spine dendritiche sono minuscole sporgenze sui rami dendritici dei neuroni, che ricevono input sinaptici dai neuroni vicini. Svolgono un ruolo cruciale nell'attività neuronale.

"Il nostro microscopio è il primo strumento al mondo in grado di raggiungere la super-risoluzione 3-D STED in profondità all'interno di un animale vivente, " ha affermato il leader del team di ricerca Joerg Bewersdorf della Yale School of Medicine. "Tali progressi nella tecnologia di imaging dei tessuti profondi consentiranno ai ricercatori di visualizzare direttamente le strutture e le dinamiche subcellulari nel loro ambiente tissutale nativo, " ha affermato Bewersdorf. "La capacità di studiare il comportamento cellulare in questo modo è fondamentale per ottenere una comprensione completa dei fenomeni biologici per la ricerca biomedica e per lo sviluppo farmaceutico".

Andando più a fondo

La microscopia STED convenzionale viene spesso utilizzata per l'immagine di campioni cellulari in coltura. Usare la tecnica per visualizzare tessuti spessi o animali vivi è molto più impegnativo, soprattutto quando i vantaggi della super risoluzione di STED sono estesi alla terza dimensione per 3-D-STED. Questa limitazione si verifica perché il tessuto spesso e otticamente denso impedisce alla luce di penetrare in profondità e di concentrarsi correttamente, compromettendo così le capacità di super risoluzione del microscopio STED.

Per vincere questa sfida, i ricercatori hanno combinato la microscopia STED con l'eccitazione a due fotoni (2PE) e l'ottica adattiva. "2PE consente l'imaging più profondo nei tessuti utilizzando lunghezze d'onda del vicino infrarosso anziché luce visibile, " disse Mary Grace M. Velasco, primo autore del saggio. "La luce infrarossa è meno suscettibile alla dispersione e, perciò, riesce a penetrare meglio in profondità nel tessuto."

I ricercatori hanno anche aggiunto l'ottica adattiva al loro sistema. "L'uso dell'ottica adattiva corregge le distorsioni alla forma della luce, cioè., le aberrazioni ottiche, che si verificano durante l'imaging all'interno e attraverso i tessuti, " ha detto Velasco. "Durante l'imaging, l'elemento adattivo modifica il fronte d'onda della luce nell'esatto contrario del tessuto nel campione. Le aberrazioni dell'elemento adattativo, perciò, cancellare le aberrazioni dal tessuto, creando condizioni di imaging ideali che consentono di recuperare le capacità di super risoluzione STED in tutte e tre le dimensioni."

Vedere i cambiamenti nel cervello

I ricercatori hanno testato la loro tecnica 3-D-2PE-STED dapprima visualizzando strutture ben caratterizzate in cellule coltivate su un vetrino coprioggetto. Rispetto all'utilizzo del solo 2PE, Volumi risolti 3-D-2PE-STED più di 10 volte più piccoli. Hanno anche dimostrato che il loro microscopio potrebbe risolvere la distribuzione del DNA nel nucleo delle cellule della pelle di topo molto meglio di un microscopio convenzionale a due fotoni.

Dopo queste prove, i ricercatori hanno usato il loro microscopio 3-D-2PE-STED per visualizzare il cervello di un topo vivente. Hanno ingrandito una parte di un dendrite e risolto la struttura 3-D delle singole spine. Hanno quindi ripreso la stessa area due giorni dopo e hanno mostrato che la struttura della colonna vertebrale era effettivamente cambiata durante questo periodo. I ricercatori non hanno osservato alcun cambiamento nella struttura dei neuroni nelle loro immagini o nel comportamento dei topi che indicherebbe un danno dall'imaging. Però, hanno in programma di studiarlo ulteriormente.

"Le spine dendritiche sono così piccole che senza una super risoluzione è difficile visualizzare la loro esatta forma 3D, per non parlare di eventuali modifiche a questa forma nel tempo, " ha detto Velasco. "3-D-2PE-STED ora fornisce i mezzi per osservare questi cambiamenti e per farlo non solo negli strati superficiali del cervello, ma anche più in profondità, dove si verificano più connessioni interessanti."