La capacità di multiplexing della microscopia a fluorescenza è fortemente limitata dall'ampia larghezza spettrale di fluorescenza. L'imaging spettrale offre potenziali soluzioni, tuttavia, gli approcci tipici per disperdere gli spettri di emissione locale ostacolano notevolmente il throughput ottenibile e pongono vincoli sostanziali alla risoluzione temporale. I filtri passa-banda sintonizzabili offrono la possibilità di scansionare attraverso la lunghezza d'onda di emissione nell'ampio campo. Però, l'applicazione di bande passanti strette all'emissione di fluorescenza comporta un uso inefficiente del segnale scarso.

In un nuovo articolo pubblicato su Luce:scienza e applicazioni , un team di scienziati, guidato dal professor Ke Xu del College of Chemistry, Università della California, Berkeley, Gli Stati Uniti hanno dimostrato che l'utilizzo di un unico, banda fissa di rilevamento dell'emissione di fluorescenza, attraverso la scansione veloce sincronizzata con il frame della lunghezza d'onda di eccitazione da una lampada bianca tramite un filtro sintonizzabile acusto-ottico (AOTF), fino a 6 bersagli subcellulari, marcato da comuni fluorofori di sostanziale sovrapposizione spettrale, può essere ripreso simultaneamente in cellule vive con bassa (~ 1%) diafonia e alta risoluzione temporale (fino a ~ 10 ms).

La capacità dimostrata di quantificare l'abbondanza di diversi fluorofori nello stesso campione attraverso la successiva separazione degli spettri di eccitazione ha permesso loro di ideare nuovi, schemi di imaging quantitativo per biosensori fluorescenti sia bi-stato che FRET (trasferimento di energia per risonanza di Förster) in cellule vive. Hanno così ottenuto un'elevata sensibilità full frame e risoluzioni spazio-temporali nella quantificazione del pH della matrice mitocondriale e dell'affollamento macromolecolare intracellulare. Hanno così svelato significative eterogeneità spaziali in entrambi i parametri, compresi improvvisi salti spontanei nel pH della matrice mitocondriale accompagnati da drammatici cambiamenti di forma mitocondriale. Hanno ulteriormente dimostrato, per la prima volta, il multiplexing dell'imaging del pH assoluto con tre ulteriori organelli/proteine ​​bersaglio per chiarire il complesso, Via mitofagica mediata da parkin.

"La potenziale estensione del nostro approccio a un numero ancora maggiore di fluorofori può essere ottenuta aumentando ulteriormente il numero di lunghezze d'onda di eccitazione o integrando la dispersione di emissione. Considerando che in questo lavoro ci siamo concentrati su un semplice sistema basato su un microscopio a epifluorescenza azionato da lampada, le capacità di imaging rapido multi-fluoroforo e quantitativo di biosensori che abbiamo dimostrato qui dovrebbero essere facilmente estensibili ad altri sistemi, compresa la microscopia a fluorescenza a foglio di luce e la microscopia a illuminazione strutturata", hanno commentato gli scienziati.

Insieme, questi risultati "svelano le eccezionali opportunità che la microscopia spettrale di eccitazione offre per l'imaging a fluorescenza altamente multiplexato. La prospettiva di acquisire immagini spettrali veloci nel campo ampio senza la necessità di dispersione di fluorescenza o la cura per la risposta spettrale del rivelatore offre un enorme potenziale, " concludono gli scienziati.