La nanoscopia descrive la capacità di vedere oltre il limite ottico generalmente accettato di 200–300 nm. La microscopia a deplezione di emissioni stimolate (STED), sviluppata da Stefan W. Hell e Jan Wichmann nel 1994, e dimostrata sperimentalmente da Hell e Thomas Klar nel 1999, è una tecnica di super risoluzione per la nanoscopia. La microscopia STED ha compiuto notevoli progressi ed è ampiamente utilizzata nella ricerca pratica. Ma il suo uso pratico comporta un rumore di fondo indesiderato, che influisce negativamente sulla risoluzione spaziale e sulla qualità dell'immagine. In generale, questo rumore proviene da due sorgenti di segnale:(i) fluorescenza generata dalla rieccitazione causata da dosi di luce ultraelevate dal fascio di svuotamento; e (ii) fluorescenza residua, dovuta all'esaurimento insufficiente del fascio di inibizione.

Negli ultimi decenni sono stati sviluppati approcci significativi per la rimozione dello sfondo. Questi possono essere suddivisi in tre categorie:dominio del tempo, dominio dello spazio e dominio dei fasori. Alcuni di questi metodi sono di vecchia data e altri sono stati sviluppati più di recente. Sebbene siano metodi efficaci per rimuovere il rumore indesiderato dalle immagini di microscopia STED, tutti comportano inconvenienti, tra cui distorsione dell'immagine, tempi di acquisizione prolungati o introduzione di rumore di ripresa. La microscopia STED deve ancora raggiungere il suo pieno potenziale.

Come riportato in Fotonica avanzata , i ricercatori dell'Università di Zhejiang hanno recentemente sviluppato un nuovo metodo chiamato "differenza a doppia modulazione" STED (dmdSTED) per sopprimere gli sfondi in modo selettivo ed efficace. Il metodo funziona ordinando i segnali del dominio spaziale nel dominio della frequenza in modo che la fluorescenza non esaurita e lo sfondo indotto da STED siano opportunamente separati dai segnali fluorescenti desiderati. I fasci di eccitazione e di svuotamento vengono caricati rispettivamente con diverse modulazioni nel dominio del tempo. Poiché evita la rieccitazione causata dal raggio di svuotamento, è possibile selezionare un laser di svuotamento con una lunghezza d'onda più vicina al picco dello spettro di emissione di fluorescenza del campione, riducendo così l'intensità di svuotamento richiesta.

L'attuale versione di dmdSTED funziona con una risoluzione spaziale di λ/8, una risoluzione superiore a quella dei metodi del dominio dei fasori (ad es. SPLIT, λ/5) che sono soggetti a rumore di sparo. Teoricamente, la potenziale perdita di segnale da parte di approcci nel dominio del tempo (come il time-gating) può essere evitata con questo approccio. Inoltre, dmdSTED è compatibile con scenari pulsati o a onda continua e non è richiesto hardware per il conteggio di fotoni singoli correlato al tempo (TCSPC). Rispetto ai metodi nel dominio dello spazio, la risoluzione temporale di dmdSTED non è limitata. Pertanto, dmdSTED è vantaggioso nell'acquisizione di immagini microscopiche complete, in risoluzione spaziale, SNR e risoluzione temporale.

Secondo l'autore senior Xu Liu, direttore dello State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, "Questo metodo nel dominio della frequenza possiede un grande potenziale per integrarsi in altre tecniche di scansione puntiforme a doppio raggio, come la microscopia a saturazione dello stato eccitato (ESSat), lo stato di carica microscopia di deplezione (CSD), microscopia di deplezione dello stato fondamentale (GSD) e così via. Inoltre, può accettare più tipi di campioni con caratteristiche spettrali diverse dai coloranti fluorescenti comunemente usati in STED, come alcuni punti quantici con uno spettro di eccitazione più ampio. " + Esplora ulteriormente

Soppressione dello sfondo per la microscopia ottica a super risoluzione