Un approccio innovativo alla calibrazione dei microscopi high-tech consente ai ricercatori di tracciare il movimento di singole molecole in 3D su scala nanometrica.

Un gruppo di ricerca della Stanford University, guidato da W. E. Moerner, estende il lavoro che è valso a Moerner e ai colleghi Eric Betzig e Stefan W. Hell il Premio Nobel 2014 per la chimica. Betzig e Moerner hanno aperto la strada allo sviluppo dell'imaging a super risoluzione, che ha rotto il limite di diffrazione della microscopia ottica utilizzando per la prima volta la fluorescenza di singole molecole. Il nuovo lavoro, pubblicato sulla rivista ad alto impatto della The Optical Society ottica , dimostra un netto miglioramento nell'accuratezza di questa tecnica di imaging e per il monitoraggio delle molecole in tre dimensioni.

Tracciare come si muovono le molecole, formare forme e interagire all'interno delle cellule e dei neuroni del corpo offre una nuova visione potente dei processi biologici chiave come la segnalazione, divisione cellulare e comunicazione neuronale, tutto ciò ha un impatto sulla salute delle persone e sulla suscettibilità alle malattie.

Sfruttare una trasformazione in microscopia

La microscopia a super risoluzione utilizza i laser per eccitare la fluorescenza da singole molecole in condizioni in cui solo poche emettono alla volta, superamento del limite di risoluzione tradizionale per la microscopia ottica fissato dal limite di diffrazione della luce.

"Con l'avvento dell'imaging ad alta risoluzione, abbiamo migliorato la risoluzione di un fattore da 5 a 10 oltre il limite di diffrazione - da 200 nanometri fino a 40 o addirittura 10 nanometri, " Ha detto Moerner. "Questo nuovo mondo di risoluzione notevolmente aumentata porta una grande trasformazione nel modo in cui funziona il sistema ottico".

Però, le precedenti tecniche di calibrazione per la microscopia a super risoluzione non erano sufficientemente accurate per le misurazioni 3D di singole molecole. Il nuovo metodo di calibrazione utilizza una matrice di nanofori per correggere le distorsioni ottiche nell'intero campo visivo di un microscopio a campo ampio.

Gestire la distorsione

Quando si esegue l'imaging su scala di singole molecole, un singolo punto di luce proveniente da una molecola può essere tipicamente localizzato con una precisione di circa 10 nanometri. A risoluzioni così elevate, eventuali piccole imperfezioni in un sistema ottico introducono distorsioni dell'immagine, o aberrazioni, che può alterare notevolmente le misurazioni, soprattutto in 3D. Gli errori risultanti potrebbero significare la differenza tra interpretare due molecole come interagenti o semplicemente essere vicine l'una all'altra.

Mentre molti usano perline fluorescenti per calibrare i microscopi 3D, Alex von Diezmann, dottorando presso il Moerner Lab, Università di Stanford, ha adottato un approccio diverso. Ha creato una serie di fori in una pellicola metallica, ciascuno più piccolo di 200 nanometri e regolarmente distanziati di 2,5 micron l'uno dall'altro, da utilizzare come standard di calibrazione 3D. Una volta riempiti i buchi con coloranti fluorescenti, l'array potrebbe essere utilizzato per calibrare gli errori ottici nell'intero campo visivo del microscopio, non solo in alcuni punti selezionati, come è possibile utilizzando perline fluorescenti. Utilizzando questa tecnica, i ricercatori sono stati in grado di correggere aberrazioni di 50-100 nanometri a soli 25 nanometri.

"Prima di questo, la gente non si era esplicitamente preoccupata di queste aberrazioni, " ha detto von Diezmann. "Il fatto che abbiamo dimostrato la presenza di aberrazioni dipendenti dal campo, e hanno mostrato che potevano degradare le immagini, è una parte importante di questo lavoro".

I ricercatori hanno studiato la nuova tecnica di calibrazione con doppia elica e funzioni di diffusione del punto astigmatico, due tipi di modifica ottica tipicamente utilizzati per estrarre la posizione dell'asse z. Sebbene entrambe le funzioni di diffusione dei punti mostrassero imprecisioni relative all'asse z che creavano un errore di circa il 20% nelle misurazioni 3D, i ricercatori hanno corretto queste aberrazioni utilizzando l'array di nanofori 3D.

Dimostrazione dei vantaggi per lo studio delle proteine ​​nei batteri

I ricercatori stanno ora applicando la nuova tecnica di calibrazione 3D a tutti i loro studi di tracciamento a singola molecola e microscopia a super risoluzione. Per esempio, von Diezmann lo sta usando per studiare la localizzazione delle proteine ​​nei batteri che misurano solo due micron di lunghezza. Con la tecnica di calibrazione 3D, può misurare e tracciare con precisione le proteine ​​di segnalazione chiave in nanodomini di dimensioni comprese tra 150 e 200 nanometri.

I ricercatori sottolineano che la correzione delle aberrazioni dipendenti dal campo e di altro tipo sta diventando sempre più importante man mano che le tecniche di microscopia ottica si evolvono per acquisire immagini più profonde nelle cellule, Per esempio.

"Abbiamo studiato questo approccio per un paio di casi, ma può essere utilizzato con qualsiasi microscopia a super risoluzione o localizzazione che richieda misurazioni 3D davvero precise, " ha detto von Diezmann. "Sarà emozionante vedere altri gruppi usarlo per capire come la loro particolare tecnica è influenzata dalle aberrazioni dipendenti dal campo. Come comunità, forse possiamo trovare modi ancora migliori per affrontare queste aberrazioni".

I ricercatori hanno prodotto uno strumento di calibrazione 3D creando una serie di fori su scala nanometrica riempiti con colorante fluorescente. In un), illuminazione widefield (verde) passa attraverso il vetrino coprioggetto in un nanoforo inciso in uno strato di alluminio. La soluzione di colorante fluorescente riempie i buchi, e i punti luminosi risultanti (arancione) vengono rilevati dal basso. La figura (b) mostra un'immagine al microscopio elettronico a scansione dei fori, di diametro pari o inferiore a 200 nanometri ciascuno.