I ricercatori della Harvard Medical School hanno migliorato la progettazione di minuscoli nanodischi, modelli sintetici di membrane cellulari utilizzati per studiare le proteine ​​che controllano ciò che entra ed esce da una cellula. I miglioramenti forniscono una visione senza precedenti di come i virus infettano le cellule.

I nuovi nanodischi sono più stabili rispetto alle versioni precedenti e, per la prima volta, può essere realizzato in diverse dimensioni e forme precise.

"Finalmente abbiamo un ambiente definito in cui possiamo studiare come i virus o altre proteine ​​interagiscono con le proteine ​​di membrana e ottenere dettagli mai visti prima, " disse Gerhard Wagner, l'Elkan Blout Professor di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare presso HMS e autore senior dello studio.

I miglioramenti del design significano che gli scienziati possono ora guardare al microscopio come virus, in questo caso, poliovirus:agganciati ai nanodischi, aprire un poro e iniettare il loro materiale genetico.

"Uno degli obiettivi principali della virologia è capire passo dopo passo come i virus entrano nelle cellule e realizzare un "film molecolare", '", ha detto il primo autore Mahmoud Nasr, un ricercatore nel laboratorio Wagner. "La speranza è che questi nanodischi ci aiutino a raccogliere maggiori dettagli su questo processo in modo da poter progettare vaccini e farmaci a piccole molecole per impedire l'ingresso del virus".

Inoltre, incorporare diverse proteine ​​nei nanodischi e farle rotolare negli spettrometri di risonanza magnetica nucleare (NMR) fornisce immagini più nitide delle strutture e delle dinamiche delle proteine ​​rispetto a quanto fosse possibile in precedenza, aiutando i ricercatori a comprendere meglio le funzioni delle proteine ​​nel corpo.

I risultati sono stati riportati in Metodi della natura il 21 novembre.

Allacciare la cintura

I cosiddetti nanodischi a doppio strato fosfolipidico sono fondamentalmente fasci di grasso legati intorno alla vita da un paio di cinture proteiche. I grassi, o lipidi, formano un doppio strato come quello della membrana cellulare naturale. Gli scienziati possono quindi incorporare le proteine ​​di membrana nel doppio strato.

I nanodischi sono emersi nei primi anni 2000 come alternativa ad altri surrogati di membrana che sono sovradimensionati o instabili o che richiedono detergenti, che interferiscono con la dinamica naturale delle proteine. Ma i nanodischi presentavano i loro problemi. Ad esempio, i ricercatori non sono riusciti a realizzarli in dimensioni coerenti, buttare via i risultati dei test.

Il team di Wagner ha riconosciuto che il problema risiedeva probabilmente nel fatto che le cinture proteiche che circondavano i nanodischi si erano aperte, in modo che i dischi si gonfiassero con quantità irregolari di lipidi.

Abbastanza sicuro, quando gli scienziati hanno fatto un po' di chimica stravagante per allacciare le cinture, i nanodischi sono usciti in una gamma di dimensioni molto più ristretta. I dischi hanno anche tenuto insieme meglio nel tempo e alle alte temperature necessarie per gli esperimenti NMR.

I ricercatori hanno scoperto che potevano accorciare o allungare le cinture e comunque chiuderle, consentendo ai nanodischi di essere dimensionati su misura per adattarsi a specifiche proteine ​​di membrana. Finora, hanno fatto dischi con diametri di 9, 11, 15 e 50 nanometri.

Essere in grado di controllare le dimensioni dei nanodischi amplia l'utilità degli strumenti per una serie di proteine ​​e tecnologie. L'NMR richiede piccoli dischi e proteine, Per esempio, mentre la microscopia elettronica spesso ne ha bisogno di grandi.

"Non puoi usare piccoli nanodischi per studiare enormi complessi proteici o per guardare virus, che necessitano di una superficie minima per formare un poro, " ha detto Nasr.

La maggior parte dei nanodischi sono circolari, sebbene gli scienziati stiano anche armeggiando con una serie di forme poligonali, dai triangoli agli esagoni.

"Speriamo che, impacchettando insieme in modo più efficiente rispetto ai nanodischi circolari, i nanodischi poligonali, soprattutto se possiamo farne di più piccole, ci aiuterà a far crescere buoni cristalli, che ci fornisce un altro modo per risolvere le strutture delle proteine ​​di membrana che incorporiamo in esse, " ha detto Nasr.

Mirino virale

In fondo al corridoio dal laboratorio di Wagner, James Hogle, l'Edward S. Harkness Professore di Chimica Biologica e Farmacologia Molecolare presso HMS, e il suo collega post-dottorato Mike Strauss si sono imbattuti in ostacoli cercando di capire come i virus siano semplici, come i poliovirus, entrare nelle cellule.

"Qualcosa deve attraversare la membrana, " Ha detto Hogle. C'erano alcune prove che i poliovirus aprissero i pori nella membrana e inviassero solo il loro materiale genetico, ma i sistemi modello che i ricercatori stavano usando, chiamati liposomi, erano troppo irregolari e instabili per mostrare cosa stava succedendo nella membrana.

"Non riuscivamo a vedere i pezzi che ci interessavano, " disse Hogle.

Desideroso di scoprire se i nanodischi modificati offrissero una visione migliore, Hogle e Strauss hanno collaborato con Wagner e Nasr.

Primo, Nasr ha costruito dischi da 50 nanometri abbastanza grandi da contenere tutti i pezzi del puzzle. Quindi il team ha incorporato proteine ​​nei nanodischi che si legano ai poliovirus, ha aggiunto particelle di poliovirus alla miscela, ha congelato i campioni e ha scattato istantanee attraverso un microscopio crioelettronico.

"Abbiamo chiesto al virus, 'Vieni attaccati al nanodisco, entra nel cell e mostraci cosa fai, '", ha spiegato Nasr.

Le immagini mostravano alcune particelle virali che abboccavano all'esca, attaccandosi alle proteine ​​del recettore, aprendo quelli che sembravano pori attraverso il doppio strato lipidico e rilasciando il loro RNA come se cercassero di infettare una cellula reale.

"Nessuno aveva mai visto un simile poro prima, " ha detto Nasr.

I ricercatori non hanno ancora confermato che gli oggetti che vedono sono veramente pori, ma, Hogle ha detto, "Sappiamo che sono lì perché l'RNA sta attraversando".

"Sembrano sicuramente dei pori, " ha aggiunto. "Come si suol dire, 'Se cammina come un'anatra, e starnazza come un'anatra...'"

Nasr sta ora cercando di realizzare dischi da 30 nanometri ancora più personalizzati per aiutare il team di Hogle a determinare la struttura del complesso proteico poliovirus/recettore e approfondire ciò che sta accadendo nella membrana.

"I nanodischi sono una tecnica entusiasmante, " ha detto Hogle. "Non riesco a immaginare nessun altro modo di vedere che aspetto ha il poro. Mahmoud è stato molto intelligente nel far funzionare tutto questo e creare un sistema che apre le porte a un'ampia varietà di studi".

I ricercatori sperano che i loro risultati iniziali incoraggino altri a utilizzare i nanodischi per esaminare molte interazioni virus/recettori. Già inondato di richieste di collaborazione, Il gruppo di Wagner ha messo a disposizione una raccolta di cinture proteiche e sta pubblicando un protocollo dettagliato in modo che altri laboratori possano costruire i nanodischi da soli.

Dettaglio struttura

Oltre a studiare l'ingresso virale, Il team di Wagner ha dimostrato che i nanodischi possono migliorare i risultati NMR e consentire lo studio di più proteine ​​di membrana mediante NMR. Questi includono recettori accoppiati a proteine ​​G, che circa il 40% dei farmaci di oggi sono progettati per colpire.

"Con questa tecnica, possiamo ottenere spettri fantastici, " disse Wagner.

Poiché i nanodischi non si rompono alle alte temperature, "possiamo fare esperimenti NMR per settimane, e i GPCR non si degradano, " ha detto Nasr.

I nanodischi sembrano anche stabilizzare le proteine ​​incorporate in essi.

"Sono altamente resistenti agli enzimi che tagliano le proteine ​​​​che entrano e li attaccano, " disse Wagner.