Grafico che mostra il gradiente di densità di saccarosio progettato dal NIST utilizzato per separare le nanoparticelle ingegnerizzate (ENP) in eccesso in soluzione dai nematodi e da qualsiasi ENP consumato. Gli ENP sciolti o attaccati esternamente sono intrappolati nello strato di sale più alto e negli strati di saccarosio a densità più bassa. I vermi con ENP ingeriti si spostano verso il basso per stabilirsi negli strati di saccarosio a densità più elevata. Credito:M. Johnson/NIST
A volte i metodi della vecchia scuola forniscono i modi migliori per studiare la tecnologia all'avanguardia e i suoi effetti sul mondo moderno.
Dare un nuovo ruolo a una tecnica di laboratorio vecchia di 65 anni, i ricercatori del National Institute of Standards and Technology (NIST) hanno eseguito la separazione più pulita fino ad oggi di nanoparticelle sintetiche da un organismo vivente. Si prevede che il nuovo metodo NIST migliorerà in modo significativo gli esperimenti che esaminano i potenziali impatti ambientali e sulla salute di queste entità fabbricate. Consentirà agli scienziati di contare in modo più accurato quante nanoparticelle sono state effettivamente ingerite dagli organismi esposti ad esse.
Un articolo che descrive il nuovo metodo appare nell'attuale numero della rivista ACS Nano .
Il comune nematode Caenorhabditis elegans è stato utilizzato negli ultimi anni come modello vivente per studi di laboratorio su come i composti biologici e chimici possono influenzare gli organismi multicellulari. Questi composti includono nanoparticelle ingegnerizzate (ENP), bit di materiale tra 1 e 100 nanometri (miliardesimi di metro, o circa 1/10, 000 il diametro di un globulo rosso). La ricerca precedente si è spesso concentrata sulla quantificazione della quantità e delle dimensioni delle nanoparticelle ingegnerizzate ingerite da C. elegans. La misurazione delle nanoparticelle che effettivamente lo trasformano in un organismo è considerata un indicatore di potenziale tossicità più rilevante della semplice quantità di ENP a cui sono esposti i vermi.
I metodi tradizionali per il conteggio degli ENP ingeriti hanno prodotto risultati discutibili. Attualmente, i ricercatori espongono C. elegans a ENP metallici come argento o oro in soluzione, quindi sciacquare via le particelle in eccesso con acqua seguita da centrifugazione e liofilizzazione. Una porzione del campione "pulito" prodotto viene quindi tipicamente esaminata con una tecnica che determina la quantità di metallo presente, nota come spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Spesso produce conteggi ENP di decine di migliaia per worm; però, quei numeri sembrano sempre troppo alti per i ricercatori del NIST che lavorano con C. elegans.
"Poiché ICP-MS rileverà tutte le nanoparticelle associate ai vermi, sia quelli ingeriti che quelli che rimangono attaccati esternamente, sospettiamo che quest'ultimo sia ciò che rende così alto il numero di "ENP" per verme, ", ha affermato la chimica analitica del NIST Monique Johnson, l'autore principale del documento ACS Nano. "Poiché volevamo solo quantificare le ENP ingerite, era necessario un metodo di separazione più robusto e affidabile."
Per fortuna, la soluzione al problema era già in laboratorio.
Un microscopio elettronico a scansione che mostra una sezione trasversale del nematode C. elegans con due nanoparticelle ingegnerizzate ingerite (punti rossi appena a destra del centro). Immagini come questa hanno fornito ai ricercatori del NIST una conferma visiva che il consumo di nanoparticelle si è effettivamente verificato. Credito:K. Scott/NIST
Nel corso della coltura di C. elegans per esperimenti di esposizione ENP, Johnson e i suoi colleghi avevano usato la centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio, un sistema decennale e consolidato per separare in modo pulito i componenti cellulari, isolare i vermi da detriti e batteri. "Ci siamo chiesti se lo stesso processo ci avrebbe permesso di eseguire anche una separazione organismo-da-ENP, così ho progettato uno studio per scoprire, " ha detto Johnson.
Nel loro esperimento, i ricercatori del NIST hanno prima esposto campioni separati di C. elegans a basse e alte concentrazioni di due dimensioni di nanosfere d'oro, 30 e 60 nanometri di diametro. I ricercatori hanno messo ciascuno dei campioni in una centrifuga e hanno rimosso il surnatante (parte liquida), lasciando i vermi e gli ENP nei pellet rimanenti. Questi sono stati centrifugati due volte in una soluzione salina (piuttosto che solo acqua come nei precedenti metodi di separazione), e poi nuovamente centrifugato, ma questa volta, attraverso un gradiente di densità di saccarosio dal design unico.
"Da cima a fondo, il nostro gradiente consisteva in uno strato di soluzione salina per intrappolare gli ENP in eccesso e tre strati sempre più densi di saccarosio [20, 40 e 50 per cento] per isolare il C. elegans, " ha spiegato Johnson. "Abbiamo seguito il gradiente con tre risciacqui con acqua e con centrifugazioni per garantire che solo i vermi con ENP ingeriti, e non il mezzo di separazione del saccarosio con eventuali ENP in eccesso, arriverebbe al pallino finale."
L'analisi della gamma di masse nei campioni ultrapurificati ha indicato livelli di oro più in linea con ciò che i ricercatori si aspettavano che sarebbero stati trovati come ENP ingeriti. La convalida sperimentale del successo del metodo di separazione NIST è arrivata quando i vermi sono stati esaminati in dettaglio al microscopio elettronico a scansione (SEM).
"Per me, il momento eureka è stato quando ho visto per la prima volta gli ENP d'oro nelle immagini in sezione trasversale prese dai campioni di C. elegans che erano stati elaborati attraverso il gradiente di densità di saccarosio, " Johnson ha detto. "Avevo sognato di trovare ENP nel tratto digestivo del verme e ora erano davvero lì!"
Le immagini SEM ad alta risoluzione hanno anche fornito prove visive che sono state contate solo le ENP ingerite. "Nessuna ENP è stata attaccata alla cuticola, l'esoscheletro di C. elegans, in uno qualsiasi dei campioni di gradiente di densità di saccarosio, " Johnson ha detto. "Quando abbiamo esaminato i vermi dai nostri esperimenti di controllo [elaborati utilizzando il tradizionale no-gradiente, metodo di separazione solo risciacquo con acqua], c'erano un certo numero di nanosfere trovate attaccate alla cuticola.
Ora che è stato dimostrato con successo, i ricercatori del NIST intendono perfezionare e convalidare ulteriormente il loro sistema per valutare l'assorbimento di ENP da parte di C. elegans. "Auspicabilmente, il nostro metodo diventerà uno strumento utile e prezioso per ridurre la variabilità delle misurazioni e i bias di campionamento che possono affliggere gli studi di nanotossicologia ambientale, " ha detto Johnson.
