Inserire o modificare i geni nelle piante è più arte che scienza, ma una nuova tecnica sviluppata dall'Università della California, Berkeley, gli scienziati potrebbero realizzare l'ingegneria genetica di qualsiasi tipo di pianta, in particolare, editing genetico con CRISPR-Cas9:semplice e veloce.

Per consegnare un gene, i ricercatori lo innestano su un nanotubo di carbonio, che è abbastanza piccolo da scivolare facilmente attraverso la dura parete cellulare di una pianta. Ad oggi, la maggior parte dell'ingegneria genetica delle piante viene eseguita sparando geni nel tessuto, un processo noto come biolistico, o fornendo geni tramite batteri. Entrambi hanno successo solo una piccola percentuale del tempo, che è una delle principali limitazioni per gli scienziati che cercano di creare colture resistenti alle malattie o alla siccità o di progettare piante in modo che vengano convertite più facilmente in biocarburanti.

nanotubi, però, hanno un grande successo nel fornire un gene nel nucleo e anche nel cloroplasto, una struttura nella cellula che è ancora più difficile da mirare con i metodi attuali. cloroplasti, che hanno il loro separato, sebbene piccolo, genoma, assorbire la luce e immagazzinare la sua energia per un uso futuro, rilascio di ossigeno nel processo. Una semplice tecnica di consegna dei geni sarebbe un vantaggio per gli scienziati che ora cercano di migliorare l'efficienza della cattura dell'energia luminosa per aumentare i raccolti.

Il nanotubo non solo protegge il DNA dall'essere degradato dalla cellula, ma impedisce anche che venga inserito nel genoma della pianta. Di conseguenza, la tecnica consente modifiche o delezioni geniche che negli Stati Uniti e in paesi diversi dall'Unione Europea non farebbero scattare la designazione "geneticamente modificato, "o OGM.

"Uno dei vantaggi è proprio il tempo risparmiato con una tecnologia come questa, " ha detto Markita Landry, un assistente professore UC Berkeley di ingegneria chimica e biomolecolare. "Ma penso che i principali progressi saranno la capacità di fornire geni in modo rapido ed efficiente alle piante attraverso le specie e in un modo che potrebbe consentire la generazione di linee di piante transgeniche senza integrazione di DNA estraneo nel genoma della pianta".

Un uso chiave sarebbe l'editing del gene CRISPR-Cas9:fornire il gene per Cas9, che è l'enzima che prende di mira e taglia il DNA, insieme alla guida per la codifica del DNA RNA, l'etichetta dell'indirizzo di Cas9, per modificare geni specifici con alta precisione. E il DNA legato a un nanotubo è molto resistente.

"Abbiamo valutato la stabilità dei costrutti e il costo e, su entrambi i fronti, questo è adatto per la scienza del garage, " Landry ha detto. "Puoi mettere queste cose in una busta e spedirle praticamente ovunque. Non hai bisogno di un frigorifero, una pistola genetica, batteri; non hai bisogno di molto per lavorare con loro, e sono stabili per mesi. Possiamo generarli su larga scala, congelarli, scongelarli:sono piccole cose robuste."

Landry e i suoi colleghi riporteranno i loro risultati online il 25 febbraio prima della pubblicazione sulla rivista Nanotecnologia della natura .

Consegna CRISPR

Landry ha scoperto che i nanotubi scivolano facilmente attraverso le pareti cellulari delle piante, che sono noti per i loro strati duri, durante il tentativo di etichettare le cellule con sensori a nanotubi. I sensori sono finiti all'interno della cella, non sulla superficie cellulare.

Ha subito visto come capovolgerlo per fornire geni nelle piante. I metodi attuali sono ingombranti e possono essere a basso rendimento. L'uso di pistole genetiche è distruttivo; è come fare un buco in una cellula vegetale e sperare che il tuo gene e la cellula sopravvivano entrambi. Non tutte le piante possono essere infettate dall'Agrobacterium portatore di geni, e un'altra tecnica, usando virus patogeni per trasportare geni, funziona per una gamma ancora più ristretta di piante e rischia di inserire il DNA virale nel genoma della pianta. Tutti devono essere personalizzati per ogni pianta, e il DNA consegnato è integrato nel genoma:la definizione di OGM.

Desideroso di provarlo, Landry e i suoi colleghi hanno avvolto il gene per la proteina fluorescente verde (GFP) attorno a un nanotubo e l'hanno iniettato in una foglia di rucola organica acquistata da un Whole Foods Market locale. Entro un giorno, le cellule vegetali brillavano di verde sotto la luce UV, indicando che il gene GFP era stato trascritto e tradotto in proteina, come se fosse il gene della pianta.

L'effetto è durato solo pochi giorni, però, probabilmente perché le proteine ​​vengono riciclate, e il DNA si degrada lentamente.

Una vita breve non è uno svantaggio, però.

"Parte di ciò che rende unica la piattaforma è che l'espressione è transitoria. Quando guardiamo al microscopio da sette a dieci giorni dopo, l'espressione è andata, la fluorescenza è sparita. Non è il caso di Agrobacterium, " ha detto Landry. Per gli scienziati che studiano come funzionano le piante, esprimere un gene per un breve periodo può dire loro molto sul ruolo del gene nella cellula.

"Perché questa sia una piattaforma ampiamente utile, però, dobbiamo esprimere una proteina che di per sé ha un effetto permanente sul genoma nucleare, " lei ha aggiunto.

Il suo piano è di impacchettare il DNA in un plasmide a filamento singolo che viene poi attaccato a un nanotubo di carbonio. Entro due o tre giorni dalla diffusione nella cellula, sia la proteina Cas9 che l'RNA guida CRISPR sarebbero espressi, permettendo loro di collegarsi per formare un complesso ribonucleoproteico che modifica il genoma, permanentemente. Non ha riscontrato alcun effetto tossico dal nanotubo.

"Così, ora hai una pianta che è stata modificata, ma sarebbe considerato non OGM al di fuori dell'Europa, " lei disse.

Ricaricare il nanotubo

Lei e i suoi colleghi hanno testato la consegna di nanotubi in altre piante:tabacco, un cavallo di battaglia della genetica vegetale; cotone, il cui genoma è notoriamente difficile da decifrare; e grano. Versioni geneticamente modificate di queste piante sono già sul mercato, ma una tecnica semplificata potrebbe accelerare l'introduzione di nuovi geni benefici. Tabacco, Per esempio, è stato progettato per produrre prodotti farmaceutici come i farmaci antitumorali.

Sebbene Landry e i suoi colleghi non abbiano ancora compreso appieno come funziona la consegna dei nanotubi, il facile ingresso dei nanotubi non è una sorpresa totale, lei disse. Le pareti cellulari delle piante lasciano scivolare facilmente le cose se sono più piccole di circa 5-20 nanometri, che è molto inferiore al limite di 500 nanometri delle cellule di mammifero. I nanotubi hanno un diametro di circa 1 nanometro, sebbene siano lunghi circa 300 nanometri:spazio sufficiente per collegare dozzine di geni. Le cellule vegetali sono dell'ordine di 10, 000 nanometri di diametro.

Lei e i suoi colleghi di laboratorio hanno provato varie tecniche per attaccare il DNA ai nanotubi e hanno scoperto che il legame più stretto funzionava meglio. Quando i ricercatori hanno dato al nanotubo una carica positiva prima di introdurre il DNA, si attaccava come carta a un pettine carico di elettricità statica.

Ora sta conducendo esperimenti con nanoparticelle di origami di DNA per capire meglio cosa sta succedendo all'interno delle cellule vegetali dopo che il nanotubo e il DNA sono entrati, e sta sperimentando la consegna di nanotubi nelle piante di altri tipi di molecole, in particolare RNA e proteine.

"La cosa sorprendente di questi nanotubi di carbonio è che sono in grado di superare la parete cellulare ed entrare nel nucleo o nei cloroplasti. È un nuovo progresso che ci consente di mettere davvero in atto gli strumenti per l'editing del genoma, "ha detto Brian Staskawicz, professore di biologia vegetale e microbica e direttore scientifico per l'agricoltura dell'Innovative Genomics Institute, che sta finanziando ulteriori lavori sulla consegna di CRISPR da Landry e dal suo team. "I prossimi passi sarebbero possiamo fornire proteine ​​ribonucleiche o possiamo fornire mRNA o DNA che codificherebbero effettivamente CRISPR-Cas9?"