Nelle scienze della vita, la capacità di misurare la distribuzione delle biomolecole all'interno di una cellula in situ è ​​un importante obiettivo investigativo. Tra una varietà di tecniche, gli scienziati hanno utilizzato l'imaging magnetico (MI) basato sul centro vacante di azoto (NV) nei diamanti come potente strumento nella ricerca biomolecolare. Però, l'imaging su nanoscala delle proteine ​​intracellulari è rimasto finora una sfida. In un recente studio ora pubblicato in Progressi scientifici , Pengfei Wang e colleghi dei dipartimenti interdisciplinari di fisica, biomacromolecole, informazioni quantistiche e scienze della vita in Cina, utilizzato proteine ​​ferritina per dimostrare la realizzazione MI di proteine ​​endogene in una singola cellula, utilizzando il centro della vacanza di azoto (NV) come sensore. Hanno ripreso le ferritine intracellulari e gli organelli contenenti ferritina utilizzando l'MI e la microscopia elettronica correlativa per aprire la strada all'imaging magnetico (MI) su scala nanometrica delle proteine ​​intracellulari.

L'aumento della risoluzione spaziale esistente dell'imaging biomedico è necessario per soddisfare le continue richieste nell'imaging medico, e quindi, tra una varietà di tecniche, l'imaging magnetico è di grande interesse al momento. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è ampiamente utilizzata per quantificare la distribuzione degli spin nucleari, ma la risonanza magnetica convenzionale può raggiungere solo una risoluzione di 1 µm nell'imaging con spin nucleare, dove la risoluzione è limitata dalla sensibilità di rilevamento elettrico. Gli scienziati hanno sviluppato una serie di tecniche per rompere questa barriera di risoluzione, tra cui un dispositivo di interferenza quantistica superconduttore e microscopia a forza di risonanza magnetica. Tuttavia, questi rapporti richiedono un ambiente criogenico e un vuoto spinto per l'imaging, limitando l'implementazione sperimentale e la sua traduzione nella pratica clinica.

Un metodo di rilevamento quantistico sviluppato di recente, basato sul centro di vacanza dell'azoto nel diamante, ha spinto radicalmente i confini delle tecniche MI su scala nanometrica per rilevare molecole organiche e proteine ​​in laboratorio. Gli scienziati hanno combinato il rilevamento quantistico con i centri NV e la microscopia a scansione di sonda per dimostrare la risonanza magnetica su scala nanometrica per lo spin di un singolo elettrone e il piccolo insieme di spin nucleare mentre utilizzano il centro NV come magnetometro biocompatibile per l'immagine non invasiva di particelle ferromagnetiche all'interno delle cellule su scala subcellulare (0,4 µm). Per esempio, la depolarizzazione del centro NV può essere utilizzata come magnetometro a banda larga per rilevare e misurare il rumore fluttuante da ioni metallici e spin nucleari. Però, tale imaging di singole proteine ​​tramite MI su scala nanometrica non è stato finora riportato nella singola cellula.

Nel presente lavoro, Wang et al. hanno riportato due progressi tecnici per consentire MI su scala nanometrica di proteine ​​intracellulari all'interno di una singola cellula. Per questo, hanno congelato la cella allo stato solido e l'hanno segmentata in modo intricato a forma di cubo, quindi lo ha posizionato su una sonda di scansione a diapason di un microscopio a forza atomica (AFM) per l'imaging, dove la sezione trasversale piatta della cella era esposta all'aria. Gli scienziati hanno utilizzato la configurazione di posizionamento del campione per consentire al sensore NV di essere posizionato entro 10 nm dalle proteine ​​bersaglio e hanno utilizzato l'AFM per sopprimere la deriva termica durante il posizionamento del campione. Hanno quindi progettato nanocolonne trapezoidali a forma di cilindro su una superficie diamantata sfusa per l'acquisizione di immagini, accorciando tecnicamente il tempo di acquisizione dell'immagine di un ordine rispetto ai metodi precedenti. In questo studio, gli scienziati hanno utilizzato questa tecnica per condurre l'MI in situ del rumore fluttuante magnetico delle proteine ​​della ferritina intracellulare (un biomarcatore delle riserve di ferro e della saturazione della transferrina nel corpo) all'interno della configurazione sperimentale.

La ferritina è un complesso proteico globulare con un diametro esterno di 12 nm, contenente una cavità di 8 nm di diametro che consente di immagazzinare fino a 4500 atomi di ferro all'interno della proteina. Il rumore magnetico degli ioni ferrici può essere rilevato a causa dei loro effetti sulla T ₁ tempo di relax di un centro NV. In questo lavoro, Wang et al. ha confermato l'osservazione mediante misure di fluorescenza del decadimento dipendente dal tempo della popolazione dei centri NV (spin magnetico, m _S =0 stato), in una superficie diamantata ricoperta di ferritine. Inoltre, gli scienziati hanno rilevato il rumore magnetico con metodi privi di etichette utilizzando il centro NV tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM). The work allowed the development of a correlated MI and TEM scheme to obtain and verify the first nanoscale MI of a protein in situ.

The scientists used the hepatic carcinoma cell line (HepG2) for the experiments and studied iron metabolism by treating the cells with ferric ammonium citrate (FAC), which significantly increased the amount of intracellular ferritin. They verified this using confocal microscopy (CFM), western blotting and TEM techniques at first. The results showed the primary localization of ferritins in the intracellular puncta around the nucleus, among the cytoplasm. The scientists used bulk electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy to confirm the paramagnetic properties of ferritin in the FAC-treated HepG2 cells and mass spectroscopy to measure the interference due to other paramagnetic metal ions.

Wang et al. then used ultrafast, high-pressure freezing to immobilize all intracellular components of the Fe-loaded cells. The process stabilized the intracellular structures and molecules by minimizing Brownian motion in cells, which typically contributes to random motion of proteins up to 100 nm in vivo. To image the samples, they embedded and polymerized the frozen cells in LR White medium, followed by gluing the embedded cell sample to the AFM tuning fork with a few cells at the tip. Using a diamond knife, the scientists then sectioned the tip surface to nanometer flatness to examine the cuboid cell section under AFM. They acquired MI images of ferritins by scanning the cell cube along the diamond nanopillars and simultaneously measured NV spin repolarization rate using the "leapfrog" scanning mode of the microscope as detailed previously.

The scientists measured fluorescence decay at a fixed free evolution time of 50 microseconds (τ =50 μs) to reveal the degree of NV sensor spin polarization, which correlated with the amount of ferritin in the sensing volume. They observed the appearance of some clusters via both TEM and MI images, although some details were not observed in MI, the results confirmed that spin noise from intracellular ferritin contributed to depolarize the NV center. In order to obtain details of the ferritin clusters at higher resolution, the scientists minimized the pixel size to 8.3 nm and acquired MI of high resolution of the proteins as expected.

In questo modo, Wang et al. explored the sensitivity of NV centers as an appropriate sensor for biological imaging applications at the level of the single molecule. They used the technique as a sensor in the experimental setup to obtain the first MI of a protein at a resolution of 10 nm in situ. The scientists aim to improve the stability and sensitivity of the technique to speed up the scanning process and image a larger area of interest in the cell and locate ferritin beyond the nucleus in association with additional organelles.

The work will contribute to clinical diagnostics to determine biomarker-based iron storage and release in cells. This will include studies on the regulatory mechanisms of iron metabolism during the progression of hemochromatosis, anemia, liver cirrhosis and Alzheimer's disease. Wang et al. propose to extend the approach in situ to other cellular components with paramagnetic signals, including magnetic molecules, metalloproteins and special spin-labelled proteins. The scientists envision that further studies will explore additional targets suitable for high-resolution MI and correlated TEM imaging techniques, with optical microscopy detection incorporated to the experimental setup to extend the work and determine protein nuclear spin MRI as well as perform three-dimensional cell tomography.

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