INIZIO:(a) Sintesi di monolite di silice porosa in capillare di silice fusa e stampo termoplastico tramite chimica sol-gel. (b) Reazioni competitive durante la sintesi del monolite. I gruppi silanolo presenti sul capillare di vetro formano legami covalenti con il monolite durante questa fase. IN BASSO:(a) Immagine SEM di un monolite di silice sintetizzato all'interno di un capillare di silice fusa con ID di 100 µm, rivelando porosità uniforme e ottimo ancoraggio a parete del monolite. (b) Istogramma della dimensione dei pori. Il diametro critico per l'emolisi dei globuli rossi (2r*) è contrassegnato da una freccia. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0063-4
La diagnostica unicellulare emergente si basa sulla possibilità di isolare i batteri in modo rapido ed efficiente da matrici biologiche complesse. In un recente studio ora pubblicato in Microsistemi e Nanoingegneria , Jung Y. Han e colleghi dei Dipartimenti interdisciplinari di Ingegneria Meccanica, L'ingegneria biomolecolare chimica e la bioingegneria negli Stati Uniti hanno sviluppato un dispositivo per isolare batteri intatti e vitali dal sangue intero utilizzando un microfluidico, monolite di silice porosa. Hanno ottenuto l'emolisi meccanica fornendo al contempo il passaggio di batteri intatti e vitali attraverso i monoliti per l'isolamento batterico basato sulle dimensioni e la lisi selettiva. Han et al. descritto un processo per sintetizzare grandi quantità di elementi monolitici legati a capillari discreti e mattoni monolitici su scala millimetrica da integrare in chip microfluidici.
Hanno esplorato l'impatto della morfologia monolitica, geometria e condizioni di flusso sulla lisi cellulare e regimi di flusso che hanno consentito la lisi cellulare selettiva e il passaggio selettivo di più batteri gram negativi e gram positivi. La tecnica impiegata da Han et al. ha consentito una rapida preparazione del campione e l'analisi batterica in combinazione con la spettrometria Raman a cellula singola. Il lavoro fornisce passaggi di preparazione del campione unici per supportare un'analisi batterica rapida e senza colture per applicazioni in dispositivi biomedici point-of-care.
I batteri nel sangue possono portare alla sepsi, infezione dei tessuti e altre gravi condizioni mediche, che richiedono l'identificazione precoce dei batteri trasmessi dal sangue per un trattamento efficace. La capacità di identificare rapidamente i batteri utilizzando la diagnostica point-of-care può migliorare notevolmente il potenziale clinico per un trattamento ottimale durante l'infezione in fase iniziale. Il gold standard esistente per la caratterizzazione batterica si basa sull'analisi fenotipica della coltura cellulare e richiede almeno 24 ore per raccogliere campioni per la coltura e l'analisi in un laboratorio di diagnostica e microbiologia clinica. La tecnica esistente è robusta e poco costosa, ma non può generare risultati tempestivi per guidare le fasi iniziali del trattamento.
(a) Integrazione di un mattone monolitico di silice in un chip termoplastico. Un nastro circolare viene posizionato su un monolite inserito in un substrato COP, e COP solvatato viene applicato alla superficie esposta. Dopo l'essiccazione parziale, il nastro viene rimosso, il dispositivo è racchiuso da un altro substrato COP, e le porte del fluido sono inserite in fori che forniscono un percorso di flusso attraverso il monolite. (b) Immagine SEM di un mattone monolito tagliato da una sega a cubetti. (c) Immagine di un dispositivo durante la perfusione di sangue intero. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0063-4
Nel presente lavoro, Han et al. esplorato dispositivi microfluidici integrati con monoliti di silice porosa come semplici elementi a flusso continuo per l'analisi selettiva delle cellule del sangue e l'isolamento intatto dei batteri. I monoliti sono materiali altamente porosi composti da morfologia a celle aperte con percorsi tortuosi del flusso di fluido. Gli scienziati possono controllare la morfologia monolitica dei pori tramite un elevato stress superficiale meccanico durante la perfusione cellulare per l'emolisi meccanica delle cellule del sangue, consentendo allo stesso tempo ai batteri intatti e vitali di percorrere i percorsi di flusso tortuosi per il loro isolamento senza colture. Han et al. utilizzato l'approccio del passaggio selettivo per i batteri nel sangue intero in condizioni di flusso per specie gram-positive e gram-negative, nonostante le differenze dei ceppi batterici. La tecnica della lisi monolitica selettiva ad alto rendimento combinata con potenti metodi analitici come la spettroscopia Raman può consentire l'analisi senza coltura di batteri nel sangue intero a livello della singola cellula.
Misurazione DLS di (a) sangue diluito iniziale 25×, sangue lisato chimicamente, e sangue lisato per perfusione attraverso il dispositivo monolitico, rivelando una significativa riduzione delle dimensioni dei detriti cellulari per la lisi meccanica dei monoliti rispetto alla lisi chimica. (b) misurazione DLS di E. cloacae sospesa in 1× PBS, e campione perfuso attraverso il dispositivo monolitico, non mostra alcun cambiamento nella dimensione dei batteri. (c) misurazione DLS di sangue diluito 100 volte addizionato con E. cloacae, e campione prelevato dall'uscita di un monolite poroso. L'ampio picco nel campione in ingresso indica una popolazione mista di cellule del sangue e piccole cellule batteriche, considerando che il campione in uscita ha mostrato una riduzione significativa delle cellule grandi (>2 µm), come confermato nelle immagini ottiche. Barre di scala = 25 µm. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0063-4
Han et al. processi di sintesi dei monoliti di silice modificati precedentemente riportati, seguita da idrolisi e condensazione della silice per formare vetro di silice a basse temperature. Per preparare il monolite di silice, gli scienziati hanno utilizzato una soluzione precursore composta da alchil silicati, glicole polietilenico (PEG) come porogeno, urea come fonte di ioni ossidrile per ridurre al minimo l'eterogeneità e l'acido acetico. Quando hanno ottimizzato il processo sintetico, i monoliti risultanti erano omogenei e ben ancorati alle pareti dei capillari di silice. Gli scienziati hanno misurato lo spessore della struttura scheletrica finale del monolite e ne hanno calcolato la permeabilità utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni per controllare le condizioni sperimentali. Per ridurre al minimo la variazione intrinseca, Han et al. tagliare i tubi capillari risultanti in segmenti lunghi 5 cm per testare la permeabilità prima dell'uso.
Hanno quindi sviluppato due metodi complementari per operazioni a bassa e alta produttività per integrare i monoliti di silice nei sistemi microfluidici. Per consentire un funzionamento a bassa produttività, gli scienziati hanno incorporato segmenti capillari contenenti monolite all'interno di chip microfluidici termoplastici per proteggere il monolite durante l'integrazione. Per la lisi selettiva ad alto rendimento hanno usato monoliti con aree trasversali più grandi all'interno dei dispositivi microfluidici. Il metodo completo di fabbricazione ha fornito un'eccellente affidabilità per un funzionamento senza perdite durante la perfusione di sangue intero.
(a) Dipendenza dalla lunghezza dei monoliti dell'emolisi dei globuli rossi. totalmente, Il sangue diluito 50× in PBS 1× è stato perfuso attraverso monoliti capillari di varie lunghezze ad una portata di 10μL/min. (b) Velocità di passaggio di globuli rossi e batteri vitali a diverse velocità di flusso e lunghezze del capillare contenente monolite. Barre di scala = 50 µm. Le barre di errore sono ±1SD. Il contrasto delle immagini ottiche è stato regolato per la visibilità. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0063-4
Come prova di principio, Han et al. selezionato Enterobacter cloacae (gram-negativi, batteri a forma di bastoncello) per esplorare la loro efficacia di passaggio, insieme a tre batteri gram-positivi; Lactococcus lactis, Micrococcus luteus e Bacillus subtilis. Durante gli esperimenti, hanno perfuso soluzioni batteriche attraverso i monoliti microfluidici con geometria e condizioni di flusso variabili per testare il passaggio dei batteri e la lisi delle cellule del sangue utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). Ad esempio, la perfusione di E. cloacae purificata attraverso il monolite non ha prodotto cambiamenti apprezzabili nei picchi DLS, indicando il passaggio intatto dei batteri.
Gli scienziati hanno mostrato l'effetto della lunghezza del dispositivo monolitico poroso sull'efficienza della lisi dei globuli rossi (RBC). I risultati hanno indicato che l'efficienza della lisi dei globuli rossi è aumentata significativamente per le lunghezze dei monoliti superiori a 1 mm. Han et al. ha anche studiato il destino dei globuli bianchi (WBC) durante il funzionamento del dispositivo monolitico, le cellule non potevano passare attraverso il monolite senza essere lisate in modo simile ai globuli rossi. tecnicamente, globuli rossi deformati a forma discoidale per passare attraverso il monolite, che ha causato un aumento significativo della tensione di membrana per provocare la lisi dei globuli rossi. Comparativamente, le cellule batteriche avevano dimensioni simili ai pori del monolite e quindi richiedevano una minore espansione della parete cellulare per un passaggio riuscito senza rotture. Gli scienziati hanno ottimizzato i parametri del dispositivo affinché diversi batteri possano tollerare livelli elevati di stress della membrana senza rotture. Ulteriori sviluppi hanno garantito il passaggio intatto dei batteri senza degradazione e con vitalità.
(a) Efficienza di lisi dei globuli rossi del sangue intero in dispositivi ad alta produttività dopo perfusione a 10 μL/min (EC E. cloacae, LL L. lactis, BS B. subtilis. Le barre di errore sono ±SD. N = 3 per il sangue e B + EC, e N = 2 per B + LL, B + BS. (b) Lisi delle cellule del sangue e separazione batterica a seguito di operazioni seriali utilizzando due monoliti. Le superfici sono state passivate con BSA/Tween 20. È stata ottenuta una lisi di RBC superiore al 99,999% preservando la vitalità di L. lactis ed E. cloacae. Barre di scala = 100 µm. c Spettri Raman di sangue intero addizionato con E. cloacae (superiore) prima e (sotto) dopo l'elaborazione attraverso monolite di silice porosa. Credito:Microsistemi e nanoingegneria, doi:10.1038/s41378-019-0063-4.
Per il passaggio batterico ad alto rendimento, gli scienziati hanno diluito il sangue nei dispositivi capillari. Però, in alternativa, potrebbero anche estendere la capacità dei monoliti per la lisi del sangue intero. I dispositivi hanno elaborato più di 400 µl di sangue intero addizionato di batteri prima di mostrare un aumento significativo della contropressione, a causa dell'ostruzione a causa della lisi cellulare e anche a causa di leucociti intatti (WBC) intrappolati all'interno della matrice porosa.
Per individuare i batteri bersaglio, Han et al. ottenuto un campione depositato su un vetrino, dopo aver attraversato il processo monolitico. Hanno condotto l'analisi Raman a cellula singola scansionando manualmente la sonda ottica attraverso il campione. Si aspettano l'uso della tecnologia di lisi selettiva, accoppiato alla microscopia Raman confocale in futuro per migliorare il processo di rilevamento dei ceppi batterici di interesse a basse concentrazioni in una posizione di interesse definita.
In questo modo, Jung Y. Han e colleghi hanno sviluppato un monolite microfluidico per isolare in modo efficiente i batteri intatti con teranostica ad ampio raggio, potenziale point-of-care per applicazioni cliniche. Prevedono l'unione di strumenti di microscopia Raman confocale che sono attualmente in gran parte confinati al laboratorio di ricerca con i sistemi emergenti miniaturizzati e portatili per aprire la strada a dispositivi point-of-care rapidi e portatili.
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