Le nematocisti sono organelli urticanti di cnidari che hanno notevoli proprietà meccaniche per subire variazioni di volume del 50% durante l'esocitosi esplosiva (processo mediante il quale le cellule espellono rifiuti e grandi molecole), pur resistendo a pressioni osmotiche oltre i 100 bar. I ricercatori hanno recentemente identificato due nuovi componenti proteici che hanno costruito la parete della nematocisti in Hydra per includere (1) una proteina-1 ricca di prolina cnidaria (CPP-1) con un motivo rigido in poliprolina, e (2) un Cnidoin elastico che possiede un dominio simile alla seta. In un nuovo studio, ora su Rapporti scientifici , Theresa Bentele e un team di ricercatori dei dipartimenti di Medicina, Evoluzione molecolare e genomica e l'Istituto di chimica fisica in Germania, Australia e Giappone, espresso Cnidoina ricombinante e proteine ​​CPP-1 in Escherichia coli .

Hanno confrontato il modulo elastico di proteine ​​bulk reticolate spontaneamente con quello di nematocisti isolate. I ricercatori hanno sistematicamente ottimizzato la fabbricazione di nanofibre proteiche uniformi utilizzando l'elettrofilatura e le condizioni di preparazione. Entrambe le fibre sono rimaste stabili anche dopo rigorosi lavaggi e immersione in acqua sfusa, a causa della reticolazione simultanea di domini ricchi di cisteina. Le nanofibre risultanti erano chiaramente diverse dalle altre nanofibre proteiche che erano instabili senza procedure di reticolazione chimica. Dopo la valutazione quantitativa delle proprietà meccaniche, hanno esaminato le applicazioni delle nanofibre Cnidoin e CPP-1 per promuovere la crescita delle cellule staminali mesenchimali umane.

I nematocisti dell'idra comprendono quattro varianti che si sviluppano nella colonna corporea dei polipi in cellule specializzate note come nematociti. L'eccezionale tenacità meccanica della struttura della parete della capsula rende le nematocisti uniche per formare materiali bioispirati in laboratorio. La capsula contiene complessi proteici reticolati da legami disolfuro intermolecolari tra domini ricchi di cisteina (CRD), che può essere utilizzato come un versatile reticolante per creare polimeri lineari o ramificati tra diverse proteine. Gli scienziati avevano già identificato due nuove proteine ​​della capsula, tra cui CPP-1 e Cnidoina, mentre studiavano le nematocisti dell'Hydra nel loro lavoro precedente. Il potenziale per combinare la Cnidoina elastica e le proteine ​​CPP-1 rigide è stata una strategia promettente per progettare nuovi biomateriali in grado di formare strutture stabili con reticolazione spontanea per realizzare flessibilità e resistenza eccezionali, simile alle capsule di nematocisti biologiche. Le nanofibre proteiche sintetiche bioispirate hanno guadagnato crescente attenzione come matrice artificiale per la coltura di cellule staminali per applicazioni di ingegneria tissutale. L'elettrofilatura offre un metodo comune per fabbricare tali fibre utilizzando proteine ​​della seta, collagene e gelatina. I prodotti in fibra sottile hanno molteplici applicazioni nella guarigione delle ferite e nell'ingegneria dei tessuti.

Nel presente lavoro, Bentele et al. ha introdotto una nuova classe di nanofibre sintetiche prive di reticolanti basate sulle proteine ​​della nematocisti dell'idra CPP-1 e Cnidoina mediante elettrofilatura. Sulla base della capacità di reticolazione spontanea dei CRD, hanno sistematicamente ottimizzato le condizioni di preparazione per bioingegnerizzare nanofibre proteiche prive di reticolanti che sono stabili sott'acqua con potenziali applicazioni per la coltura di cellule staminali umane. Il team di ricerca ha ottenuto immagini rappresentative di immunofluorescenza di un'idra coniugata con anticorpi CPP-1 (verde) e Cnidoina (rosso) per co-localizzare le proteine ​​nella parete della capsula. Le immagini hanno indicato la presenza di Cnidoina come più densamente impacchettata all'interno delle pareti di nematocisti mature rispetto a CPP-1. Successivamente, Bentele et al. ha utilizzato metodi Western blot per identificare le capsule di nematocisti native isolate e le proteine ​​ricombinanti (proteine ​​espresse in altri organismi); che hanno prodotto in E. coli. I risultati hanno indicato notevoli modifiche post-traduzionali di CPP-1 in Hydra. Hanno confermato i risultati utilizzando la proteina CPP-1 espressa in E. coli e hanno dedotto sia CPP-1 che Cnidoina come proteine ​​strutturali della parete del nematocisti integrate durante la formazione o la morfogenesi.

I ricercatori hanno quindi testato le proprietà meccaniche delle nematocisti Hydra e delle proteine ​​sfuse utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia a forza atomica (AFM). Gli scienziati hanno estratto la distribuzione dei moduli elastici e misurato ulteriormente l'elasticità del CPP-1 ricombinante purificato (reCPP-1) e della Cnidoina (reCnidoin) espressi in E. coli. Hanno quindi ottimizzato la produzione di nanofibre introducendo glicole polietilenico (PEG) 900 kDa nella soluzione pura per ottenere una maggiore viscosità del prodotto. Il team ha studiato l'influenza dell'umidità relativa, che ha influito in modo significativo sulla qualità delle nanofibre, mentre la forza ionica o la conduttività delle soluzioni di filatura non ha mostrato alcuna influenza sulle nanofibre.

Sulla base dei risultati preliminari dello sviluppo e della caratterizzazione dei materiali, Bentele et al. nanofibre proteiche fabbricate mediante elettrofilatura della soluzione proteina-PEG su vetrini coprioggetto. Le nanofibre recCPP-1-PEG appena filate hanno mostrato una larghezza e un'altezza uniformi su una superficie di 50 x 50 µm ² area e ha mostrato un modulo elastico uniforme. Il team ha quindi misurato la topografia della superficie, ottenuto una mappa di elasticità e una curva caratteristica forza-indentazione per le nanofibre di reCPP-1 e reCnidoina (a) in aria, (b) in aria dopo il lavaggio con acqua, e in (c) soluzione tampone fisiologica. Potrebbero rimuovere il PEG lavando con acqua per ottenere uno spessore della fibra significativamente ridotto per le nanofibre di reCnidoina, sebbene le dimensioni fossero meno pronunciate rispetto a reCPP-1 dopo il trattamento dell'acqua.

Però, le fibre non si dissolvono completamente dopo il lavaggio con acqua e conservano i loro moduli elastici. I risultati suggeriscono che le due proteine ​​ricombinanti possono stabilire nanofibre stabili formando spontaneamente legami disolfuro tra i terminali CRD (dominio ricco di cisteina). Le proteine ​​ricombinanti della nematocisti Hydra prodotte in questo lavoro hanno anche formato nanofibre uniformi e stabili attraverso CRD naturali all'interno dell'aria e in un tampone fisiologico. Il team ha esaminato le applicazioni di queste nanofibre con colture stabili di cellule staminali mesenchimali umane per 20 giorni di incubazione, durante il quale circa il 95% delle cellule ha mostrato crescita cellulare e vitalità sui nuovi materiali bioispirati.

In questo modo, Theresa Bentele e colleghi hanno proposto un nuovo biomateriale in nanofibre sintetico privo di reticolanti, bioispirato dalle proteine ​​della capsula nematocisti di Hydra. Hanno espresso proteine ​​ricombinanti di due proteine ​​della capsula di nematocisti CPP-1 e Cnidoina recentemente identificate all'interno di E. coli e hanno preparato nanofibre tramite elettrofilatura. Come risultato dei domini ricchi di cisteina (CRD), le fibre elettrofilate potrebbero reticolarsi spontaneamente tramite legami disolfuro. Le proteine ​​ricombinanti reCPP-1 e reCnidoin hanno formato nanofibre uniformi che erano stabili in acqua direttamente dopo l'elettrofilatura. I nuovi costrutti di materiali hanno dimostrato il potenziale come materiali biocompatibili ispirati alla struttura dura ed elastica del nematocisti Hydra.

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