Le linee cellulari iniettate con acido nucleico libero sono ampiamente utilizzate per la scoperta di farmaci e la modellazione di malattie. Per evitare popolazioni cellulari geneticamente miste, i ricercatori utilizzano tecniche di diluizione per selezionare singole cellule che genereranno quindi linee identiche. Però, il percorso delle diluizioni limitanti è noioso e richiede tempo.

Un nuovo studio dei ricercatori della Northwestern mostra come la Nanofountain Probe Electroporation (NFP-E), uno strumento che fornisce molecole in cellule singole, potrebbe risolvere quel problema, e potrebbe portare a nuove applicazioni per lo screening dei farmaci e la progettazione di corsi di trattamento specifici per il paziente.

Il gruppo, guidato da Horacio Espinosa della Northwestern Engineering e comprendente Joshua Leonard, dimostra la versatilità di NFP-E, che introduce il DNA o l'RNA nelle cellule usando l'elettricità. Può anche fornire sia proteine ​​che plasmidi in una varietà di tipi di cellule animali e umane con controllo del dosaggio. Il team includeva John Kessler, il Ken e Ruth Davee Professore di biologia delle cellule staminali e professore di neurologia e farmacologia presso la Northwestern University Feinberg School of Medicine.

Il nuovo metodo può essere utilizzato per studiare la malattia o per la terapia cellulare. Nella prima, il genoma è manipolato. In quest'ultimo, l'editing genetico avviene in cellule come le cellule T per trattare il cancro con le immunoterapie.

Utilizzando l'elettroporazione a cella singola, il processo di introduzione di DNA o RNA in singole cellule utilizzando un impulso di elettricità, che aprono brevemente i pori della membrana cellulare, il loro lavoro mostra come NFP-E ottenga un controllo preciso sull'espressione relativa di due plasmidi co-trasfettati. Inoltre, accoppiando l'elettroporazione a cellula singola con l'imaging fluorescente time-lapse, la loro indagine rivela tempi caratteristici per la chiusura dell'elettroporo.

"Abbiamo dimostrato il potenziale della tecnologia NFP-E nella manipolazione di una varietà di tipi di cellule con controllo stechiometrico del carico molecolare che può essere utilizzato per condurre un'ampia gamma di studi sullo screening dei farmaci, terapie cellulari, e biologia sintetica, " disse Espinosa, James N. e Nancy J. Farley Professore di Produzione e Imprenditorialità e professore di ingegneria meccanica e (per cortesia) ingegneria biomedica e ingegneria civile e ambientale.

Attualmente, le biomolecole possono essere rilasciate nelle cellule in numerosi modi:vettori virali; vettori chimici, come peptidi che penetrano nelle cellule e nanocapsule polimeriche; lipofectamina, ed elettroporazione di massa.

"Esistono una serie di strategie per fornire biomolecole nelle cellule, ma ognuno ha i suoi limiti, "disse Leonardo, professore associato di ingegneria chimica e biologica e Charles Deering McCormick Professor of Teaching Excellence. "Ad esempio, i vettori chimici conferiscono una somministrazione relativamente lenta e possono essere tossici per la cellula; i vettori virali sono spesso efficienti ma possono indurre risposte immunitarie avverse e genotossicità inserzionale. L'uso di qualsiasi metodo tradizionale spesso richiede uno sforzo sostanziale per ottimizzare il protocollo a seconda del tipo di cellula e della molecola da consegnare, e, perciò, una strategia di rilascio di biomolecole facilmente generalizzabile offrirebbe alcuni vantaggi significativi".

Il nuovo sistema NFP-E consente il rilascio di DNA da una singola cellula, RNA, e proteine ​​in diverse linee cellulari immortalizzate e cellule primarie con oltre il 95 percento di efficienza e oltre il 90 percento di vitalità cellulare.

"I risultati indicano che il tempo di risigillatura della membrana cellulare è scalabile in modo non lineare con la tensione dell'impulso e il numero di impulsi di elettroporazione, raggiungendo un massimo a valori intermedi, Espinosa ha detto. "Ciò significa che tempi di pulsazione lunghi o alti voltaggi non sembrano essere necessari per un efficiente trasporto molecolare attraverso le membrane cellulari. Questa caratteristica è importante per ottenere un'elevata efficienza di trasporto mantenendo al minimo la tossicità cellulare".

Utilizzando la tecnologia di elettroporazione a cella singola, i ricercatori sono stati in grado di comprendere i meccanismi di trasporto coinvolti nel campionamento cellulare basato sull'elettroporazione localizzata. Un ostacolo al campionamento temporale non distruttivo di una singola cellula sono le piccole quantità di citosol, il fluido all'interno delle cellule, che vengono estratte, il che rende difficile testare o rilevare sequenze di RNA o proteine.

La ricerca ha dimostrato che il ridimensionamento del tempo di risigillatura della membrana è una funzione di vari parametri di elettroporazione, fornendo informazioni sulla dinamica degli elettropori post-impulso.

"Il lavoro affronta la necessità di comprendere i modi per aumentare la quantità di citosol campionata, senza influenzare negativamente le cellule, " Ha detto Espinosa. "Questo può guidare la comunità di ricerca nella progettazione di esperimenti mirati al campionamento basato sull'elettroporazione di molecole intracellulari per l'analisi delle cellule temporali".

Questa ricerca è correlata al lavoro precedente che ha sviluppato un metodo minimamente invasivo per campionare le cellule che può essere ripetuto più volte. Quella precedente indagine, che usava impulsi elettrici per estrarre enzimi dal citosol, comprensione assistita della cinetica di formazione e chiusura dei pori.

La carta, "Nanofountain Probe Electroporation Enables Versatile Single-Cell Intracellular Delivery and Investigation of Postpulse Electropore Dynamics" è stato pubblicato il 2 ottobre sulla rivista Piccolo .