Nella ricerca di immagini di strutture e fenomeni estremamente piccoli con maggiore precisione, gli scienziati hanno spinto i limiti della risoluzione del microscopio ottico, ma questi progressi spesso comportano maggiori complicazioni e costi.

Ora, ricercatori in Giappone hanno dimostrato che una superficie di vetro incorporata con nanoparticelle d'oro autoassemblate può migliorare la risoluzione con pochi costi aggiuntivi anche utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, facilitando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in grado di acquisire immagini ad alta velocità di cellule viventi.

Poiché i microscopi ottici ingrandiscono la luce per ottenere immagini dettagliate di una struttura, la dimensione degli oggetti che possono essere distinti è stata a lungo limitata dalla diffrazione, una proprietà della luce che fa sì che si diffonda quando passa attraverso un'apertura.

I ricercatori hanno sviluppato tecniche per superare questi limiti con sistemi ottici altamente avanzati, ma molti di loro dipendono dall'uso di laser potenti, che possono danneggiare o addirittura uccidere le cellule viventi, e scansione del campione o elaborazione di più immagini, che inibisce l'imaging in tempo reale.

"Le tecniche recenti possono produrre immagini straordinarie, ma molti di loro richiedono attrezzature altamente specializzate e non sono in grado di osservare il movimento delle cellule viventi, "dice Kaoru Tamada, illustre professore presso l'Istituto per la chimica e l'ingegneria dei materiali dell'Università di Kyushu.

Cellule di imaging utilizzando metodi di microscopia a fluorescenza in tempo reale, Tamada e il suo gruppo hanno scoperto che potevano migliorare la risoluzione con un microscopio convenzionale a largo campo avvicinandosi al limite di diffrazione semplicemente cambiando la superficie sotto le cellule.

Nella microscopia a fluorescenza, le strutture cellulari di interesse sono etichettate con molecole che assorbono energia dalla luce in entrata e, attraverso il processo di fluorescenza, riemetterlo come luce di un colore diverso, che viene raccolto per formare l'immagine.

Sebbene le cellule vengano solitamente visualizzate su vetro normale, Il gruppo di Tamada ha rivestito la superficie del vetro con uno strato autoassemblato di nanoparticelle d'oro ricoperte da un sottile strato di biossido di silicio, creando una cosiddetta metasuperficie con proprietà ottiche speciali.

Solo 12 nm di diametro, le nanoparticelle metalliche organizzate mostrano un fenomeno noto come risonanza plasmonica superficiale localizzata, che consente alla metasuperficie di raccogliere energia dalle vicine molecole emettitrici di luce per una riemissione altamente efficiente, producendo così emissioni potenziate confinate alla superficie delle nanoparticelle di 10 nm di spessore.

"Introducendo le nanoparticelle, abbiamo effettivamente creato un piano che emette luce con uno spessore di pochi nanometri, " spiega Tamada. "Poiché la luce di interesse viene emessa da uno strato così sottile, possiamo concentrarci meglio su di esso".

Ulteriori vantaggi derivano dal trasferimento di energia alla metasuperficie veloce, localizzare ulteriormente i punti di emissione riducendo la diffusione, e l'alto indice di rifrazione della metasuperficie, che aiuta a migliorare la risoluzione secondo il limite di diffrazione di Abbe.

Usando la metasuperficie, i ricercatori hanno ripreso in tempo reale cellule di topo note come fibroblasti 3T3 che sono state geneticamente modificate per produrre una proteina chiamata paxillina che viene modificata per emettere luce verde quando viene eccitata. La paxillina svolge un ruolo chiave nella creazione di aderenze focali, punti in cui le molecole nella membrana cellulare interagiscono con il mondo esterno.

Illuminando l'intero campione con luce laser perpendicolare alla superficie, i ricercatori sono stati in grado di visualizzare i cambiamenti nella paxillina vicino alla membrana cellulare con una risoluzione più elevata utilizzando la metasuperficie anziché il vetro.

Inclinando la luce di illuminazione per ottenere una riflessione interna totale, i ricercatori potrebbero ottenere immagini con un contrasto ancora più elevato perché la maggior parte della luce di illuminazione viene riflessa dalla superficie con solo una piccola quantità che raggiunge il lato della cella, riducendo così l'emissione vagante prodotta dall'illuminazione che penetra in profondità nella cellula.

L'analisi delle immagini registrate ogni 500 millisecondi con una fotocamera digitale a super risoluzione ha rivelato chiare differenze di intensità su punti che coprono solo pochi pixel, indicando che la risoluzione era di circa 200 nm, vicino al limite di diffrazione.

Le cellule potrebbero anche essere visualizzate più a lungo sulla metasuperficie perché l'emissione è stata migliorata nonostante un'energia di input inferiore, riducendo così il danno cellulare nel tempo.

"Le metasuperfici sono un'opzione promettente per migliorare la risoluzione per i ricercatori di tutto il mondo che utilizzano microscopi ottici convenzionali che già possiedono, " commenta Tamada.

Oltre a continuare a migliorare le superfici da utilizzare con i microscopi convenzionali, i ricercatori stanno anche esplorando i vantaggi che possono avere per sistemi di microscopi più sofisticati.