I ricercatori della Northwestern Medicine guidati da Ruli Gao, Ph.D., assistente professore di biochimica e genetica molecolare, hanno sviluppato un nuovo strumento di sequenziamento genetico che accelera l'analisi di sequenziamento dei genotipi e dei fenotipi delle stesse cellule nei tumori, come dettagliato in uno studio pubblicato in Comunicazioni sulla natura .
Il sequenziamento dell'RNA a nanopori a cellula singola è un nuovo tipo di sequenziamento genetico che spinge avanti le attuali tecniche di sequenziamento dell'RNA a cellula singola ad alto rendimento dal sequenziamento di prossima generazione (NGS), che può sequenziare solo brevi filamenti di RNA, al sequenziamento di terza generazione a lunga lettura. sequenziamento di generazione (TGS), che può misurare direttamente l'intera lunghezza degli RNA.
Tuttavia, è noto anche che la tecnica avanzata produce elevati errori di sequenziamento e si basa anche sul sequenziamento di letture brevi, generando dati NGS abbinati per guidare l'identificazione dei dati cellulari, o sull'utilizzo di una lista bianca di codici a barre per dividere i dati in celle vere e singole. molecole.
"Questa tecnica si basa su codici a barre cellulari e codici a barre di singole molecole, quelli che noi chiamiamo identificatori univoci di molecole, per ottenere un rendimento elevato, in modo da vedere le sfide dovute a maggiori errori di sequenziamento nelle sequenze di codici a barre. I metodi attualmente disponibili dipendono dai dati di prossima generazione o dipendono da una lista bianca teorica per riconoscere quali sono i veri codici a barre cellulari e gli identificatori univoci delle molecole", ha affermato Gao, che è anche membro del Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center della Northwestern University.
Per migliorare questo processo, il team di Gao ha sviluppato scNanoGPS (single-cell Nanopore sequencing analysis of Genotypes and Phenotypes Simultaneously), un nuovo strumento di sequenziamento che esegue una deconvoluzione completamente indipendente di letture lunghe soggette a errori in singole cellule e singole molecole.
"Per facilitare ulteriormente le applicazioni della nuova tecnologia nella ricerca genomica, scNanoGPS costruisce moduli funzionali aggiuntivi per calcolare sia i genotipi (mutazioni) che i fenotipi (espressioni geniche e isoformi) in singole cellule da dati di sequenziamento di RNA nanoporo a singola cellula ad alto rendimento", ha affermato Cheng-Kai Shiau, Ph.D., ricercatore post-dottorato nel laboratorio Gao e co-primo autore dello studio.
scNanoGPS aumenta la produttività del sequenziamento da centinaia a migliaia di cellule, che è paragonabile alle attuali tecniche di sequenziamento di RNA a singola cellula basate su letture brevi ampiamente applicate, e i profili di espressione tra dati a lettura breve e a lettura lunga sono altamente concordanti, secondo Gao.
"Grazie alla copertura dell'intero corpo genico, i dati a lettura lunga consentono calcoli di isoforme di splicing e alterazioni genetiche che vengono in gran parte perse dal sequenziamento di RNA a singola cellula a lettura breve", ha affermato Gao.
Per convalidare il loro strumento, il team di Gao ha utilizzato scNanoGPS per sequenziare le cellule tumorali renali e i linfociti, scoprendo che le cellule esprimono combinazioni specifiche di isoforme e mutazioni genetiche per tipo di cellula.
"Abbiamo trovato isoforme specifiche del tipo di cellula, comprese isoforme specifiche delle cellule tumorali e isoforme specifiche delle cellule immunitarie, e abbiamo anche dimostrato profili di mutazione specifici del tipo di cellula all'interno degli stessi tumori", ha affermato Lina Lu, Ph.D., ricercatrice post-dottorato presso il Laboratorio Gao e co-primo autore dello studio.
"È noto che le isoforme di splicing alternativo sono un meccanismo post-trascrizione fondamentale per aumentare la complessità delle proteine nelle cellule umane. Siamo entusiasti di notare che scNanoGPS consente la misurazione diretta delle isoforme di splicing a livello di singola cellula", ha affermato Gao.
Per quanto riguarda le applicazioni future, Gao spera che scNanoGPS possa essere utilizzato per identificare isoforme specifiche del tipo di cellula che contribuiscono a diverse malattie umane come il cancro, l'insufficienza cardiaca e persino il rigetto del trapianto di organi.
"Le nuove tecnologie rendono la generazione dei dati relativamente più semplice, tuttavia i ricercatori non possono utilizzare i nuovi tipi di dati in modo efficace senza un robusto strumento di calcolo. scNanoGPS colma un divario tra le tecnologie e le applicazioni. Speriamo di rendere disponibile e accessibile la potente tecnologia di sequenziamento di singole cellule a lunga lettura a tutti i laboratori generali", ha affermato Gao.
Ulteriori informazioni: Cheng-Kai Shiau et al, Analisi di sequenziamento a lunga lettura di singole cellule ad alto rendimento di genotipi e fenotipi della stessa cellula nei tumori umani, Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39813-7
Informazioni sul giornale: Comunicazioni sulla natura
Fornito dalla Northwestern University
