un'immagine TEM (a sinistra, riprodotta almeno 3 volte) e schizzi (a destra) della struttura dell'origami del DNA utilizzata per l'assemblaggio della nanoantenna con la posizione dell'hotspot plasmonico indicata in rosso. Un'immagine TEM mediata di classe rappresentativa dell'origami di DNA utilizzato è mostrata in alto a destra. b Schemi dell'assemblaggio di NACHOS:il costrutto dell'origami del DNA è legato alla superficie rivestita di BSA-biotina tramite interazioni biotina-NeutrAvidin, Le particelle di argento 100 nm funzionalizzate con DNA tiolato sono attaccate alla nanoantenna dell'origami del DNA tramite filamenti di legame di poliadenina (A20) nella geometria a cerniera per ridurre al minimo la distanza tra l'origami e le nanoparticelle30. c Immagine TEM di un NACHOS con nanoparticelle di argento da 100 nm (riprodotto almeno 3 volte). d Transitori di intensità di fluorescenza a singola molecola, misurato mediante microscopia confocale, normalizzato alla stessa potenza di eccitazione di un singolo colorante Alexa Fluor 647 incorporato in un origami di DNA (arancione) e in una nanoantenna di origami di DNA con due nanoparticelle di argento da 100 nm (blu) eccitate a 639 nm e. Distribuzione del miglioramento della fluorescenza di Alexa Fluor 647 misurata in NACHOS con nanoparticelle di argento da 100 nm. Sono state analizzate un numero totale di 164 e 449 singole molecole nel riferimento (ulteriori esempi sono forniti nella Fig. 3 supplementare) e le strutture NACHOS, rispettivamente. Credito: Comunicazioni sulla natura (2021). DOI:10.1038/s41467-021-21238-9
I ricercatori della Ludwig-Maximilians-Universitaet (LMU) di Monaco di Baviera mostrano che la luce emessa da una singola molecola può essere rilevata con una configurazione ottica a basso costo. Il loro prototipo potrebbe facilitare la diagnostica medica.
I biomarcatori svolgono un ruolo centrale nella diagnosi della malattia e nella valutazione del suo decorso. Tra i marcatori ora in uso ci sono i geni, proteine, ormoni, lipidi e altre classi di molecole. I biomarcatori possono essere trovati nel sangue, nel liquido cerebrospinale, urina e vari tipi di tessuti, ma la maggior parte di loro ha una cosa in comune:si verificano in concentrazioni estremamente basse, e sono quindi tecnicamente difficili da rilevare e quantificare.
Molte procedure di rilevamento utilizzano sonde molecolari, come anticorpi o brevi sequenze di acidi nucleici, che sono progettati per legarsi a specifici biomarcatori. Quando una sonda riconosce e si lega al suo bersaglio, reazioni chimiche o fisiche danno luogo a segnali di fluorescenza. Tali metodi funzionano bene, purché siano sufficientemente sensibili da riconoscere il biomarcatore rilevante in un'alta percentuale di tutti i pazienti che lo portano nel sangue. Inoltre, prima che tali test basati sulla fluorescenza possano essere utilizzati nella pratica, i biomarcatori stessi oi loro segnali devono essere amplificati. L'obiettivo finale è quello di consentire lo screening medico direttamente sui pazienti, senza dover inviare i campioni a un laboratorio distante per l'analisi.
Le antenne molecolari amplificano i segnali di fluorescenza
Filippo Tinnefeld, che detiene una cattedra in Chimica Fisica presso LMU, ha sviluppato una strategia per determinare i livelli di biomarcatori presenti in basse concentrazioni. È riuscito ad accoppiare sonde di DNA a minuscole particelle d'oro o d'argento. Coppie di particelle ("dimeri") agiscono come nano-antenne che amplificano i segnali di fluorescenza. Il trucco funziona come segue:le interazioni tra le nanoparticelle e le onde luminose in arrivo intensificano i campi elettromagnetici locali, e questo a sua volta porta ad un massiccio aumento dell'ampiezza della fluorescenza. In questo modo, i batteri che contengono geni di resistenza agli antibiotici e persino i virus possono essere rilevati in modo specifico.
"Negli ultimi anni sono state studiate nano-antenne a base di DNA, " dice Kateryna Trofymchuk, primo autore congiunto dello studio. "Ma la fabbricazione di queste nanostrutture presenta delle sfide". Il gruppo di ricerca di Philip Tinnefeld è ora riuscito a configurare i componenti delle loro nano-antenne in modo più preciso, e nel posizionare le molecole di DNA che fungono da sonde di cattura nel sito di amplificazione del segnale. Insieme, queste modifiche consentono di amplificare più efficacemente il segnale di fluorescenza. Per di più, nel minuscolo volume coinvolto, che è dell'ordine degli zeptolitri (uno zeptolitro equivale a 10-21 di litro), possono essere catturate anche più molecole.
L'alto grado di controllo del posizionamento è reso possibile dalla nanotecnologia del DNA, che sfrutta le proprietà strutturali del DNA per guidare l'assemblaggio di tutti i tipi di oggetti su scala nanometrica, in numero estremamente elevato. "In un campione, possiamo produrre simultaneamente miliardi di queste nano-antenne, utilizzando una procedura che consiste essenzialmente nel pipettare insieme alcune soluzioni, " dice Trofymchuk.
Diagnostica di routine sullo smartphone
"Nel futuro, "dice Viktorija Glembockyte, anche co-autore primo della pubblicazione, "La nostra tecnologia potrebbe essere utilizzata per test diagnostici anche in aree in cui l'accesso all'elettricità o alle apparecchiature di laboratorio è limitato. Abbiamo dimostrato che possiamo rilevare direttamente piccoli frammenti di DNA nel siero del sangue, utilizzando un portatile, microscopio basato su smartphone che funziona con un alimentatore USB convenzionale per monitorare il dosaggio." Gli smartphone più recenti sono generalmente dotati di fotocamere piuttosto buone. A parte questo, tutto ciò che serve è un laser e una lente, due componenti facilmente reperibili ed economici. I ricercatori della LMU hanno usato questa ricetta di base per costruire i loro prototipi.
Hanno continuato a dimostrare che i frammenti di DNA che sono specifici per i geni di resistenza agli antibiotici nei batteri potrebbero essere rilevati da questo set-up. Ma il test potrebbe essere facilmente modificato per rilevare un'intera gamma di tipi di target interessanti, come i virus. Tinnefeld è ottimista:"L'anno passato ha dimostrato che c'è sempre bisogno di metodi diagnostici nuovi e innovativi, e forse la nostra tecnologia può un giorno contribuire allo sviluppo di un test diagnostico economico e affidabile che può essere eseguito a casa".
