Western blot, una tecnica analitica utilizzata per individuare una specifica proteina in un dato campione, impiega la capacità di un enzima o di un anticorpo primario marcato con fluorescenza per legarsi al suo antigene specifico. Si tratta di un processo in tre fasi che inizia con l'elettroforesi su gel, seguito da blotting della membrana e sondaggio con anticorpi. Il rilevamento delle proteine ​​può essere diretto o indiretto, con quest'ultimo che utilizza un anticorpo secondario marcato diretto contro il primario. Sebbene accettata come una routine di analisi delle proteine, il western blot ha dei limiti e dei benefici.

Vantaggio: Sensibilità

Uno dei maggiori argomenti a favore del western blot è la sua sensibilità. A causa della sua capacità di rilevare fino a 0,1 nanogrammi di proteine ​​in un campione, la tecnica può teoricamente servire come strumento diagnostico precoce efficace, rilevando anche la minima risposta immunogenica da un virus o da un batterio in un campione di paziente. Una macchia occidentale indiretta si basa ulteriormente su questa sensibilità dalla capacità dell'anticorpo secondario di amplificare l'intensità del segnale rilevato dal sistema di imaging. Maggiore sensibilità significa che sono necessari meno anticorpi per il test, il che riduce significativamente i costi di laboratorio.

Vantaggio: Specificità

La tecnica del western blot deve la sua specificità a due grandi fattori che contribuiscono. Innanzitutto, l'elettroforesi su gel ordina un campione in proteine ​​di diverse dimensioni, carica e conformazione. Questo processo è di per sé un enorme passo verso il rilevamento, poiché le bande formate nel gel forniscono già indizi sulla dimensione della proteina o del polipeptide di interesse. La specificità dell'interazione anticorpo-antigene è il secondo fattore principale. Poiché gli anticorpi specifici mostrano affinità per proteine ​​specifiche, il processo può rilevare selettivamente una proteina bersaglio anche in una miscela di 300.000 diverse proteine.

Svantaggio: incline a risultati falsi o soggettivi

Nonostante la sua sensibilità e specificità, un western blot può ancora produrre risultati errati. Un risultato falso positivo quando un anticorpo reagisce con una proteina non intenzionale, che è ciò che spesso accade quando un paziente sottoposto a test per l'HIV ha una tubercolosi o un numero di infezioni parassitarie. Un falso negativo, d'altra parte, può facilmente risultare se alle proteine ​​più grandi non viene dato il tempo sufficiente per trasferirsi correttamente alla membrana. Il blotting e l'elaborazione impropri spesso producono bande distorte, sbiadite o persino multiple, rendendo i risultati dei test soggetti all'interpretazione del tecnico.

Svantaggio: alto costo e richiesta tecnica

Il costo di un western blot è un composito delle grandi spese individuali per anticorpi marcati, analisti esperti e attrezzature di laboratorio. Un processo delicato, il western blotting richiede precisione in ogni fase per una corretta identificazione dei costituenti di un campione. Un errore minore nella concentrazione del reagente o nel periodo di incubazione può essere disastroso per l'intero processo. Infine, l'attrezzatura necessaria per il rilevamento e l'imaging - sistemi di rivelazione a chemiluminescenza, fluorescenza, radioattività o laser - può essere troppo costosa per l'unità di microbiologia media.