Prima che possano sequenziare il DNA o alterarlo attraverso l'ingegneria genetica, gli scienziati devono prima isolarlo. Questo potrebbe sembrare un compito difficile, dal momento che le cellule contengono un'ampia varietà di altri composti come proteine, grassi, zuccheri e piccole molecole. Fortunatamente, i biologi possono utilizzare le proprietà chimiche del DNA per separare il DNA da questi contaminanti e prepararlo per ulteriori studi. Questo processo è chiamato estrazione del DNA.

Lisi cellulare

Esistono molte tecniche diverse utilizzate per l'estrazione del DNA. Quello utilizzato da un singolo laboratorio dipende dal tipo di esperimento da eseguire e da quanto deve essere puro il DNA. Generalmente gli scienziati iniziano con un campione contenente cellule - un campione di sangue o di tessuto, ad esempio - e rompono le cellule aperte o le lisano. Ci sono una varietà di modi in cui puoi lisare le cellule. L'aggiunta di un detergente causerà la loro separazione, così come li sottoporrà a onde sonore ad alta frequenza. In alternativa, mescolando il campione con perle di vetro e facendolo vibrare rapidamente, si rompono fisicamente le cellule e si rilasciano i loro contenuti.

Approcci rapidi e sporchi

Se non si richiede un'elevata purezza, gli scienziati possono aggiungere un l'enzima chiamato proteinasi K per abbattere la maggior parte delle proteine ​​nel campione, quindi usarlo così com'è. Questa tecnica è molto sporca, tuttavia, poiché la maggior parte dei contaminanti sono ancora presenti, quindi è adatta solo se la velocità è una priorità e la purezza non è un problema. Un altro approccio rapido e sporco è quello di rimuovere le proteine ​​aumentando la concentrazione di sale aggiungendo sali come ammonio o acetato di potassio per forzare le proteine ​​a precipitare. Anche questa tecnica è abbastanza sporca dato che molti altri contaminanti sono ancora presenti.

Estrazione fenolo-cloroformio

Un altro approccio è quello di lisare le cellule con il detergente quindi miscelare la soluzione con isoamil alcol, cloroformio e fenolo . La soluzione quindi si separa in due strati. Le proteine ​​finiscono nello strato organico superiore, mentre il DNA rimane nello strato acquoso inferiore. Questa tecnica richiede un attento controllo della concentrazione e del pH del sale per buoni risultati. Richiede molto tempo e sia il fenolo che il cloroformio sono sostanze chimiche altamente tossiche. Di conseguenza, mentre le estrazioni con fenolo-cloroformio erano una volta di routine, altre tecniche sono diventate più popolari negli ultimi anni.

Cromatografia a scambio anionico

La cromatografia a scambio anionico offre maggiore purezza e risultati più coerenti del fenolo -estratto di cloroformio Un tubo o una colonna è pieno di piccole particelle che hanno siti caricati positivamente su di essi dove una molecola o anione caricati negativamente possono legarsi. Il DNA si lega a questi siti di scambio anionico mentre altri contaminanti come le proteine ​​e l'RNA vengono lavati via dalla colonna. Successivamente, una soluzione ricca di sali viene utilizzata per estrarre il DNA dalla colonna.

Kits

La tecnica più rapida e forse più affidabile per la purificazione del DNA è l'uso di un kit appositamente fabbricato. Questi kit contengono membrane di gel di silice in un tubo. Il DNA si attacca alla membrana mentre altri contaminanti vengono lavati via utilizzando una serie di soluzioni saline appositamente preparate fornite con il kit. Infine, il DNA viene lavato via dalla colonna con una soluzione a basso contenuto di sale. Questi kit sono veloci, facili da usare e offrono risultati riproducibili.

Assorbanza

Una volta che il DNA è stato isolato e risospeso in una soluzione tampone a controllo pH, l'ultimo passo è testarne la purezza . Un modo semplice e conveniente per farlo è controllare la quantità di luce ultravioletta che assorbe alle lunghezze d'onda di 260 e 280 nanometri. L'assorbimento a 260 nanometri diviso per assorbimento a 280 nanometri dovrebbe essere uguale a 1,8 se il DNA è puro. Misurare l'assorbanza a 260 nanometri consente anche di determinare la concentrazione del DNA.