1. Sequenziamento del DNA:
* Sequenziamento diretto: Questo è il metodo più comune e diretto. La regione di interesse del DNA viene amplificata usando PCR (reazione a catena della polimerasi) e quindi sequenziata utilizzando tecniche di sequenziamento automatizzate. La sequenza viene quindi confrontata con una sequenza di riferimento (di solito una sequenza wild-type o normale). Eventuali differenze nelle sequenze indicano una mutazione.
* Sequenziamento di prossima generazione (NGS): Questa è una tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento che può sequenziare contemporaneamente milioni di frammenti di DNA. NGS è particolarmente utile per rilevare mutazioni nelle grandi regioni del genoma o per identificare le mutazioni in una popolazione di cellule.
2. Elettroforesi:
* Polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP): Questa tecnica utilizza enzimi di restrizione, che tagliano il DNA a sequenze specifiche. Se una mutazione cambia un sito di restrizione, la dimensione dei frammenti di DNA prodotti verrà modificata. Questo può essere visualizzato usando l'elettroforesi su gel.
* Polimorfismo conformazionale a filamento singolo (SSCP): Questa tecnica utilizza il fatto che le molecole di DNA a singolo filamento con mutazioni si piegano in modo diverso. Le molecole piegate diversamente migrano in modo diverso su un gel, consentendo il rilevamento di mutazioni.
3. Saggi molecolari:
* Ibridazione dell'oligonucleotide (ASO): Questa tecnica utilizza brevi sonde di DNA complementari a alleli specifici. Le sonde che corrispondono all'allele mutata si ibridano al DNA, mentre le sonde che corrispondono all'allele di tipo selvaggio no.
* Reazione a catena della polimerasi (PCR) con primer specifici per mutazione: I primer PCR sono progettati per amplificare in modo specifico l'allele mutata. Se la mutazione è presente, il prodotto PCR verrà amplificato, mentre non sarà amplificato se la mutazione è assente.
4. Analisi fenotipica:
* Cambiamenti nei tratti osservabili: Alcune mutazioni comportano cambiamenti osservabili nel fenotipo dell'organismo, come cambiamenti di colore, dimensioni o comportamenti. Questi cambiamenti possono essere usati per identificare le persone con mutazioni.
* Saggi funzionali: Ciò comporta testare l'attività di una proteina o enzima che è codificata dal gene mutato. Se la proteina o l'enzima non è funzionale o ha attività alterata, questo può essere usato per identificare la mutazione.
5. Tecniche di coltura cellulare:
* Linee cellulari immortalate: Alcune linee cellulari possono essere coltivate in laboratorio e possono essere utilizzate per studiare le mutazioni. Queste linee cellulari possono essere utilizzate per studiare gli effetti delle mutazioni sulla crescita cellulare, la proliferazione e altri processi cellulari.
* Tecnologie di editing genetico: Strumenti come CRISPR-Cas9 possono essere utilizzati per introdurre mutazioni specifiche nelle linee cellulari, consentendo lo studio degli effetti della mutazione.
6. Studi sulla popolazione:
* Frequenza di mutazione: Studiando la frequenza delle mutazioni in una popolazione, i biologi possono identificare mutazioni associate a malattie o fenotipi specifici.
* Genetica della popolazione: Gli studi genetici della popolazione possono tracciare l'evoluzione delle mutazioni nel tempo e il loro impatto sulla forma fisica della popolazione.
È importante notare che i metodi utilizzati per determinare se si è verificata una mutazione varierà a seconda del contesto specifico e della domanda di ricerca affrontata. La combinazione di più approcci può spesso fornire prove più solide per la presenza di una mutazione.
