Ci sono voluti più di 10 anni di lavoro, ma quando si trattava di scoprire i segreti della struttura molecolare degli enzimi, la perseveranza è stata ripagata. Studiando e confrontando gli enzimi di degradazione della cellulosa di due funghi, i ricercatori del National Renewable Energy Laboratory (NREL) del Dipartimento dell'Energia hanno individuato regioni su questi enzimi che possono essere prese di mira tramite l'ingegneria genetica per aiutare a scomporre la cellulosa più velocemente.

Appena pubblicato in Comunicazioni sulla natura , "Ingegneria potenziata l'attività della cellobioidrolasi" descrive lo studio a lungo termine del NREL sulle cellobioidrolasi fungine (CBH), enzimi che utilizzano l'idrolisi come sostanza chimica principale per degradare la cellulosa. Trichoderma reesei (TrCel7A) e Penicillium funiculosum (PfCel7A). Anni di meticolose ricerche hanno prodotto grandi ricompense:il team ha acquisito una migliore comprensione delle relazioni struttura-attività di questi enzimi per prevedere i posti migliori per apportare modifiche e miglioramenti.

Sia in natura che nei processi industriali, gli enzimi di questa famiglia sono tra gli enzimi più significativi per la scomposizione della cellulosa. Un proiettato 2, Un impianto di etanolo cellulosico da 000 tonnellate al giorno potrebbe potenzialmente utilizzarne fino a 5, 000 tonnellate di enzimi all'anno, e metà di quel cocktail di enzimi potrebbe provenire da questa famiglia di enzimi. "Negli ultimi decenni si è cercato di capire e migliorare i biocatalizzatori di questa famiglia di enzimi chiave, " ha detto Gregg Beckham, capogruppo al NREL e autore senior dello studio. "Più efficiente è l'enzima, meno enzima utilizzato, e quindi il processo è più economico. Però, abbiamo ancora molta strada da fare per essere in grado di apportare miglioramenti in una capacità predittiva".

Quindi, nel 2005, I ricercatori del NREL Mike Himmel, Steve Decker, e Bill Adney ha scoperto un CBH da un fungo diverso, PfCel7A, e ha scoperto che ha prestazioni migliori del 60% rispetto a TrCel7A. "Ci ha sorpreso che questo enzima fosse molto migliore dello standard del settore, " disse Decker, che ha guidato l'attività dopo che Adney ha lasciato la NREL. "Abbiamo condotto molti esperimenti negli ultimi anni per essere sicuri che l'attività fosse reale. Poi, Certo, volevamo sapere perché era meglio."

"Se potessimo capire le differenze strutturali, allora potremmo potenzialmente usare quell'informazione per progettare enzimi migliori, che a sua volta potrebbe aiutare a ridurre il costo del biocarburante cellulosico e della produzione biochimica, "ha detto Beckham. "Data la sfida di lavorare con questi enzimi, ci sono voluti al team di NREL sette anni di accurato lavoro sperimentale per sviluppare gli strumenti necessari per accertare che ci siano un paio di punti caldi su questi due CBH che possono essere modificati per renderli migliori".

Secondo Decker, "Al tempo, gli strumenti per l'ingegneria genetica in Trichoderma erano molto limitati, ma sapevamo dal lavoro precedente che altri ospiti avevano problemi nell'esprimere queste proteine. Fondamentalmente siamo partiti da zero e abbiamo costruito il nostro sistema interno di ceppi ospiti di T. reesei, vettori, e protocolli di trasformazione e screening. Rispetto a sistemi ben sviluppati come E. coli, la scarsa efficienza di trasformazione di T. reesei, noiosi processi di selezione, crescita lenta, e la bassa resa proteica ha reso questa operazione impegnativa. Ogni varietà che abbiamo costruito ha richiesto mesi dalla progettazione al test finale".

La scoperta si è sviluppata quando NREL ha esaminato da vicino le somiglianze tra TrCel7A e PfCel7A e poi ha lavorato per isolare le differenze. Entrambi gli enzimi hanno un'architettura a tre domini:la molecola legante i carboidrati che li lega alla cellulosa; il dominio catalitico che scompone la cellulosa; e il collegamento che collega questi due domini insieme. Il team di ricerca ha quindi condotto esperimenti di scambio di domini creando una libreria chimera, che è una raccolta di enzimi mutanti creati dai due enzimi genitori.

"Con tre domini tra due genitori, che fa otto combinazioni in totale, " ha detto Beckham. "Abbiamo testato le varie combinazioni per scoprire quale area fornisce all'enzima prestazioni migliori, e forse non sorprendentemente, col senno di poi, è il dominio catalitico."

Con quei riscontri, i ricercatori hanno quindi confrontato i domini catalitici di TrCel7A e PfCel7A e hanno trovato otto aree diverse. Continuando a restringere le possibilità, il team ha preso il genitore TrCel7A e ha apportato modifiche, uno alla volta, in quelle otto aree e ha scoperto due importanti modifiche che hanno portato TrCel7A a funzionare quasi al livello del genitore PfCel7A.

"Quei due, cambiamenti molto piccoli su questa enorme proteina hanno sostanzialmente raddoppiato le prestazioni di TrCel7A, "ha detto Beckham. "Ciò che questo insegna ai ricercatori che fanno ingegneria proteica su questi enzimi incredibilmente impegnativi è che ci sono cambiamenti molto minori a questo dominio catalitico che possono essere modificati per influenzare drasticamente le prestazioni dell'enzima, rendendolo in grado di abbattere la cellulosa più velocemente e consentendo così ai processi industriali di utilizzare meno enzimi."

"Sapevamo che la scoperta di PfCel7A era importante all'epoca, ma la strada da percorrere non era del tutto chiara, " disse Himmel, il leader del progetto globale. "Abbiamo affrontato prima la famiglia di cellulasi più difficile da migliorare, e quindi ne consegue che gli enzimi che degradano la biomassa di altre famiglie possono essere resi massimamente attivi in ​​un processo più snello, con meno ricerca e sviluppo. È stata la fusione di biochimica sperimentale e scienza computazionale che ha portato questo studio a Comunicazioni sulla natura e quel risultato è stato possibile solo con finanziamenti sostenuti dall'Ufficio per le tecnologie bioenergetiche".

L'obiettivo finale del team NREL è aiutare altri ricercatori a setacciare la montagna di dati genomici per trovare enzimi migliori, basandosi unicamente sulla loro sequenza genetica. "Tra 10 anni, sarebbe così eccitante essere in grado di sedersi con migliaia di sequenze enzimatiche di questa famiglia ed essere in grado di prevedere quali poche provare, "ha detto Beckham. "Questo studio è un passo su una strada molto lunga, ma è un gol degno".