Ricercatori russi dell'Istituto di fisica generale Prokhorov dell'Accademia russa delle scienze (GPI RAS) e dell'Istituto di fisica e tecnologia di Mosca (MIPT) hanno sviluppato il primo metodo ultrasensibile al mondo per il rilevamento rapido di piccole molecole. Questo metodo rileva tracce di tossine, ormoni, vitamine e altre molecole biologicamente attive che sono significative per il monitoraggio dell'assistenza sanitaria e della sicurezza alimentare, tra le altre possibili applicazioni. Lo studio è pubblicato nel numero di novembre di Analytica Chimica Acta .

Il nuovo dosaggio a flusso laterale si basa su etichette magnetiche e richiede meno di 30 minuti. È 100 volte più sensibile del test di immunoassorbimento enzimatico, o ELISA, utilizzato per i test di laboratorio convenzionali. Gli autori hanno dimostrato l'efficacia del nuovo approccio su un test modello che misura la tiroxina nel siero del sangue umano. La tiroxina è uno degli ormoni chiave prodotti dalla ghiandola tiroidea ed è utile per il monitoraggio della sua funzione. La procedura di analisi è economica e abbastanza semplice da essere eseguita presso il punto di cura, subito dopo il prelievo di sangue.

Il motivo per cui è necessario rilevare composti di piccole molecole con elevata sensibilità è che spesso hanno un forte effetto sul corpo anche in piccole concentrazioni. Attualmente l'ELISA è considerato il gold standard per misurare la concentrazione di piccole molecole. Però, questo metodo richiede laboratori adeguatamente attrezzati con personale altamente qualificato per la sua attuazione. La sensibilità del rilevamento dell'ormone tiroideo potrebbe essere aumentata tramite saggi radioimmunoterapici con marcatori radioattivi che hanno emivite brevi nonostante i loro limiti significativi e sono potenzialmente pericolosi. Altre analisi convenzionali richiedono una lunga preparazione del campione e attrezzature specializzate.

Il saggio a flusso laterale (LFA), ampiamente noto per la sua applicazione nei test di gravidanza, rappresenta un'alternativa interessante. Rispetto a ELISA, è meno elaborato e tecnicamente complesso. Però, in molti paesi, ha l'approvazione normativa per ottenere risultati soglia solo e solo per quei casi per i quali non è essenziale un'elevata sensibilità. È quindi uno degli obiettivi principali della diagnostica medica sviluppare un metodo per il rilevamento di piccole molecole che sia rapido, sensibile, e semplice.

Nello studio riportato in questa storia, un team di ricerca congiunto di GPI RAS e MIPT ha sviluppato un kit di analisi che utilizza un LFA modificato con nanoetichette magnetiche e ligandi bifunzionali. Per testare le capacità e i limiti del nuovo sistema, gli autori hanno scelto di rilevare la tiroxina, il principale ormone della tiroide, come un modello. Inoltre ha dotato la loro ricerca di significato clinico.

Il layout del nuovo immunodosaggio magnetico differisce dal convenzionale LFA sotto diversi aspetti (vedi figura 1). Il siero del sangue di un paziente, che è testato per la tiroxina libera, è integrato contemporaneamente con anticorpi marcati con nanoparticelle magnetiche e con un ligando tiroxina bifunzionale. Questo ligando bifunzionale è una tiroxina legata covalentemente alla biotina tramite un "ponte" che collega le due molecole ma le distanzia. Gli anticorpi sulle nanoparticelle magnetiche possono quindi legarsi sia alla tiroxina del siero sanguigno che al ligando bifunzionale. Dopo un certo periodo di tempo, abbastanza perché le molecole nella soluzione si leghino l'una all'altra, la miscela viene depositata su una membrana. Le particelle legate al ligando bifunzionale sono intrappolate sulla linea di test della streptavidina, una proteina che possiede un'affinità straordinariamente elevata per la biotina. Per recuperare i risultati del test, i ricercatori hanno utilizzato apparecchiature elettroniche originali, che impiega il metodo di quantificazione delle particelle magnetiche ultrasensibile, o MPQ. Implica la rimagnetizzazione non lineare delle particelle mediante un campo magnetico alternato a due frequenze e un successivo rilevamento della risposta induttiva alle frequenze combinatorie. Insieme alla precisione del metodo MPQ, l'elevata affinità del ligando bifunzionale verso la striscia reattiva garantisce una sensibilità del saggio senza precedenti raggiungendo un limite di rilevazione di circa 1 milione di molecole dell'ormone per millilitro (16 femtogrammi!) con un range dinamico di tre ordini.

Petr Nikitin, dottorato di ricerca, che ha guidato il gruppo di ricerca, ha condiviso maggiori dettagli sullo studio:"I nostri metodi per misurare la concentrazione di composti di piccole molecole vengono eseguiti tramite strisce immunocromatografiche universali con streptavidina sulla linea di rilevamento. Quindi, sono facili da replicare e scalare. Per sviluppare test per altri analiti avremmo bisogno di anticorpi standard e speciali ligandi bifunzionali, la cui sintesi per piccole molecole è impegnativa".

"Fortunatamente, il nostro kit di strumenti include tecniche e apparecchiature interferometriche originali che abbiamo sviluppato in precedenza, che consentono il rilevamento in tempo reale delle dinamiche di interazione molecolare, " ha spiegato Petr Nikitin, diplomato al MIPT nel 1979 e responsabile di un laboratorio presso GPI RAS. "Abbiamo usato questa attrezzatura per identificare gli immunoreattori ottimali e i ligandi bifunzionali tiroxina-biotina, che per natura del loro distanziamento, la struttura "a ponte" rende disponibili entrambe le piccole molecole per un'interazione efficace con entrambe le grandi molecole, vale a dire, con l'anticorpo di rilevamento e la streptavidina. Ci ha fatto risparmiare molto tempo per lo sviluppo dei test e ha ampiamente contribuito al successo di questa ricerca".

L'autore principale del documento, Alexey Orlov, dottorato di ricerca, ricercatore presso GPI RAS e Nanobiotechnology Lab del MIPT, ha aggiunto:"Utilizziamo particelle magnetiche come nanoetichette di reazioni immunochimiche. Un dispositivo portatile rileva quantitativamente queste particelle con una precisione record dall'intero volume della zona di reazione 3D su una striscia reattiva, piuttosto che dalla superficie di una membrana, come accade nel caso delle etichette ottiche. Questo è uno dei fattori che garantisce la semplicità delle nostre misurazioni a concentrazione ultrabassa di piccole molecole in mezzi complessi. Di conseguenza, praticamente chiunque è in grado di eseguire analisi sensibili in modo univoco senza un'elaborata preparazione del campione."

"Il nuovo test è una tecnica di test point-of-care le cui caratteristiche superano notevolmente i sistemi esistenti per la diagnostica di laboratorio, " ha detto Sergey Znoyko, dottorato di ricerca, il primo autore del saggio. "Nel futuro, ampliando la gamma di molecole biologiche rilevabili in questo modo, saremmo in grado di eseguire un'analisi multiparametrica di mezzi complessi come il sangue che sarebbe molto più economico dei suoi attuali analoghi".

"Questo approccio è semplice, conveniente, e adattabile per il rilevamento di altre piccole molecole, " ha detto la studentessa laureata del MIPT Natalia Guteneva, che ha co-autore dello studio. "Speriamo che venga utilizzato attivamente per la ricerca di nuovi marcatori di malattie, nella diagnostica medica, monitoraggio ecologico, controllo della sicurezza alimentare, biosicurezza, e altrove."