Le nanomacchine proteiche costituite da più molecole proteiche sono altamente dinamiche durante le loro azioni sui loro bersagli funzionali, talvolta chiamati substrati. Le dinamiche di queste grandi nanomacchine proteiche di peso molecolare superiore a megadalton sono refrattarie all'analisi strutturale mediante la tecnologia esistente come la cristallografia a raggi X e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Microscopia crioelettronica (crio-EM), una tecnologia emergente per la determinazione della struttura ad alta risoluzione, ha il potenziale per visualizzare le dinamiche di nanomacchine proteiche di grandi dimensioni, ma le ricostruzioni crio-EM esistenti di strutture altamente dinamiche sono state limitate a una risoluzione da moderata a bassa.

Gli scienziati hanno a lungo sognato di decodificare le dinamiche di grandi macchine molecolari di dimensioni megadalton in dettaglio atomico, il determinante ultimo delle loro funzioni biologiche. Ora, un team di biofisici dell'Università di Pechino, Il Dana-Farber Cancer Institute e la Harvard Medical School hanno utilizzato la crio-EM per visualizzare le dinamiche a livello atomico del proteasoma da 2,5 megadalton, la più grande macchina nota per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule eucariotiche, durante la sua azione chemio-meccanica su un substrato proteico. Hanno ricostruito una procedura dinamica quasi completa di elaborazione del substrato nel proteasoma umano a una risoluzione senza precedenti che ha permesso la determinazione dei dettagli atomici in 3-D, simile a girare un film 3D atomo per atomo.

"Questo lavoro apre la strada allo studio della termodinamica delle nanomacchine megadalton con precisione atomica lontano dall'equilibrio, " disse Youdong Mao, un biofisico e autore corrispondente su un nuovo documento rivoluzionario pubblicato nel primo numero della rivista Natura nel 2019. "Questo studio apre numerose possibilità per la scoperta di farmaci basati sulla struttura mirati al proteasoma umano per il trattamento del mieloma multiplo e delle malattie neurodegenerative".

Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) è la più importante via di degradazione delle proteine ​​nelle cellule. Mantiene l'equilibrio dei materiali proteici nelle cellule viventi, e svolge un ruolo cruciale nella rapida degradazione delle proteine ​​regolatorie, proteine ​​mal ripiegate o proteine ​​danneggiate. UPS è probabilmente coinvolto in tutti i processi cellulari, come il ciclo cellulare, regolazione dell'espressione genica e così via. Il metabolismo proteico anomalo causato dal disturbo UPS è direttamente correlato a molte malattie umane, incluso il cancro. Nel 2004, Aaron Ciechanover, Irwin Rose e Avram Hershko hanno ricevuto il Premio Nobel per la chimica per aver scoperto questo percorso di degradazione. Il cuore dell'UPS è il proteasoma responsabile della rottura dei substrati etichettati con ubiquitina. È una delle macchine oloenzimatiche più fondamentali e complicate nelle cellule. L'oloenzima del proteasoma umano contiene almeno 33 diversi tipi di subunità con un peso molecolare totale di circa 2,5 megadalton. È anche conosciuto come il bersaglio diretto di diversi farmaci a piccole molecole approvati dalla FDA degli Stati Uniti per il trattamento del mieloma multiplo.

Utilizzando cryo-EM in combinazione con la tecnologia di apprendimento automatico, il team ha determinato le strutture dinamiche del proteasoma umano impegnato nel substrato in sette stati conformazionali intermedi con una risoluzione di 2,8-3,6 , catturato durante la degradazione di una proteina poliubiquitilata. A questa risoluzione, il team è stato in grado di identificare singoli ioni di magnesio legati sia all'ATP che all'ADP nelle mappe di densità crio-EM. Queste strutture 3D illuminano un notevole continuum spaziotemporale di interazioni dinamiche substrato-proteasoma.

intrigante, il team ha scoperto che l'inizio della traslocazione del substrato è ampiamente coordinato con altri eventi regolatori dinamici che preparano il proteasoma alla degradazione processuale del substrato. Attraverso un'ulteriore analisi sistematica, il team ha scoperto come l'energia chimica dell'idrolisi dell'ATP viene convertita nel lavoro meccanico del dispiegamento del substrato attraverso un processo altamente concertato di cambiamenti conformazionali multiproteici.

La loro scoperta fornisce nuove informazioni sul ciclo completo dell'elaborazione del substrato e suggerisce modalità distinte seguite dall'idrolisi dell'ATP nell'oloenzima del proteasoma. Si ritiene che sia la prima volta che un ciclo completo di idrolisi sequenziale di ATP in un motore eteroesamerico AAA-ATPasi è stato visualizzato a livello atomico. Questo risolve un dibattito scientifico di lunga data sugli esameri dell'ATPasi tra due modelli ipotizzati, uno suggerisce l'idrolisi sequenziale dell'ATP e l'altro ipotizza eventi idrolitici casuali nell'anello esamerica. In particolare, il team ha osservato tre modalità principali di idrolisi dell'ATP altamente coordinata, caratterizzato da eventi idrolitici in due ATPasi opposte, in due ATPasi adiacenti, e in un ATPasi alla volta. Queste modalità idrolitiche regolano elegantemente la deubiquitilazione, inizio della traslocazione, e dispiegamento processivo dei substrati, rispettivamente.

Il team ha notato alcune limitazioni in questo studio, incluso il fatto che la molteplicità di eventi di elaborazione dei nucleotidi in ATPasi distinte durante le transizioni tra stati consecutivi del proteasoma potrebbe aver comportato l'assenza di passaggi veloci e stati intermedi scarsamente popolati nelle loro ricostruzioni crio-EM. Il team prevede la prospettiva di ulteriori esplorazioni al riguardo identificando questi intermediari mancanti per chiarire come gli eventi idrolitici dell'ATP e lo scambio di nucleotidi sono coordinati tra loro, e legato allostericamente alla traslocazione del substrato. "È necessario un ulteriore sviluppo della tecnologia di analisi dei dati per estrarre informazioni ancora più dinamiche dallo stesso set di dati, " Ha detto Mao. "C'è una lunga strada da percorrere per la tecnologia di apprendimento automatico basata sui dati per liberare completamente il potenziale potere della crio-EM nella risoluzione di complesse dinamiche di macchine molecolari megadalton".