Il team ha dimostrato le capacità di Action-PAINT su nanostrutture di DNA sintetico che espongono siti di attracco vicini identici per filamenti di imager. In una prima fase i siti di attracco sono stati visualizzati mediante microscopia a super-risoluzione (a sinistra), poi, con l'aiuto di uno speciale pacchetto software, i singoli siti di attracco selezionati manualmente sono stati etichettati reticolando i fili dell'imager ad essi con radiazioni UV (al centro), e infine, gli eventi di etichettatura di successo sono stati verificati da un ulteriore ciclo di microscopia a super risoluzione (a destra). Credito:Wyss Institute presso l'Università di Harvard
Per capire come le singole molecole svolgono il loro ruolo nei processi biologici all'interno delle cellule in cui sono sintetizzate, i ricercatori hanno sviluppato metodi di microscopia a super risoluzione per visualizzarli a livello di singola molecola. Però, per indagare sulle loro funzioni, in definitiva, vorrebbero anche essere in grado di modificarli individualmente a questa alta risoluzione. Mentre la visualizzazione delle singole molecole ha fatto passi da gigante negli ultimi anni, finora è rimasto difficile modificarli direttamente in modo controllato, modo da molecola a molecola.
Ora, segnalato in Chimica della natura , ricercatori del Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering e della Harvard Medical School (HMS) di Harvard, hanno sviluppato "Action-PAINT, " un metodo che combina l'approccio di microscopia a super risoluzione DNA-PAINT in tempo reale del team con una strategia di etichettatura di singola molecola in una posizione desiderata all'interno di nanostrutture sintetiche o cellule intatte. Questo approccio potrebbe essere ulteriormente sviluppato per consentire ai ricercatori di stimolare o inibire il funzioni delle singole molecole e studiare le conseguenze per i normali processi biologici e patologici in tempo reale e super-risoluzione.
"I metodi di imaging a super risoluzione ci hanno permesso di "vedere ciò che prima era invisibile". Accoppiando il nostro metodo di microscopia a super risoluzione DNA-PAINT con un approccio di reticolazione, ora possiamo anche "toccare ciò che prima era inaccessibile" attaccando una maniglia fisica a molecole osservabili individualmente proprio al momento della visualizzazione, ", ha affermato Peng Yin, membro della facoltà principale del Wyss Institute, dottorato di ricerca, che ha condotto lo studio. Yin è anche co-leader della Molecular Robotics Initiative dell'Istituto, e professore di biologia dei sistemi presso HMS.
Il team di Yin ha sviluppato un approccio in due fasi che prima visualizza singole proteine o altre molecole a super-risoluzione, e quindi trasferisce un'etichetta molecolare al sito bersaglio desiderato. Facoltativamente, i ricercatori possono confermare i trasferimenti di successo con un ciclo aggiuntivo di imaging a super risoluzione.
Il primo passo dell'imaging a singola molecola si basa sul metodo DNA-PAINT che ha permesso al team di determinare prima la precisa localizzazione di molecole o caratteristiche molecolari che sono spazialmente separate da distanze ben al di sotto del limite di diffrazione della luce, e quindi invisibile alla maggior parte dei microscopi. I ricercatori hanno prima attaccato un breve "filo di aggancio" di DNA al bersaglio che funge da sito di legame per un "filo di imager" complementare che trasporta un colorante fluorescente. Poiché il filamento dell'imager si lega con una velocità di accensione/spegnimento programmabile, produce eventi definiti "lampeggianti" che possono essere osservati utilizzando microscopi standard. Per attaccare un'etichetta fisica al bersaglio, i ricercatori hanno effettuato la loro prima fase di imaging a super risoluzione con un filamento imager leggermente più complesso che includeva anche un cross linker fotoinducibile, che è in grado di collegare chimicamente il filamento di docking e imager tra loro quando esposto a radiazioni UV, e un'ulteriore sequenza di reporter.
Per etichettare i bersagli proteici individuali nelle cellule intatte con Action-PAINT, i filamenti di aggancio sono attaccati a molecole anticorpali che si legano a proteine bersaglio con elevata specificità. Tutti gli eventi di legame dell'anticorpo alle proteine bersaglio in un'area definita vengono visualizzati con filamenti di imager fluorescenti complementari utilizzando la microscopia a super risoluzione (a sinistra), e le proteine bersaglio in aree selezionate a mano mostrate come quadrangoli verdi (al centro) sono etichettate da eventi di reticolazione. Finalmente, gli eventi di cross-linking di successo sono confermati dall'utilizzo di filamenti di imager secondari e immagini a super risoluzione (a destra). Credito:Wyss Institute presso l'Università di Harvard
"Una componente fondamentale del nostro nuovo metodo è il controllo preciso del laser di reticolazione, che funziona in sincronia con la sequenza di lampeggi a super risoluzione. Questo converte davvero la nostra microscopia a super-risoluzione DNA-PAINT da un metodo di imaging passivo a uno attivo, consentendo l'interazione in tempo reale tra il ricercatore e i singoli bersagli molecolari, ", ha detto l'autore co-primo e co-corrispondente Mingjie Dai.
Per abilitare questa nuova capacità, il team ha sviluppato un pacchetto software che ha permesso loro di mappare prima le posizioni precise di tutti i bersagli molecolari in un'area di interesse utilizzando il metodo DNA-PAINT, e quindi sincronizzare strettamente il lampeggio di un UV con i successivi eventi di lampeggio. "In questo modo potremmo legare chimicamente il filamento dell'imager a bersagli molecolari selezionati su misura, uno per uno, con risoluzione molecolare, come un pittore stende il suo colore, patch per patch in stile puntinismo, " disse Dai, dottorato di ricerca, un ex borsista postdottorato nella squadra di Yin, che attualmente è un Departmental Fellow presso il Department of Systems Biology and Technology Development Fellow di HMS presso il Wyss Institute.
Per dimostrare l'efficacia e la selettività del loro approccio, il team ha utilizzato per la prima volta nanostrutture di DNA sintetico che hanno esposto i siti di aggancio per i filamenti di imager in modelli definiti. "Mettere in azione Action-PAINT, abbiamo iniziato dimostrando la sua efficacia etichettando bersagli di singole molecole distanti solo da 30 a 70 nm dai loro vicini identici con elevate efficienze sul bersaglio, " ha detto il co-primo autore Ninning Liu, dottorato di ricerca, "e quindi convalidato ulteriormente il nostro metodo in celle fisse, dove abbiamo selezionato ed etichettato le proteine dei microtubuli lungo i filamenti del citoscheletro, con diversi modelli personalizzati." Liu è un borsista post-dottorato nella squadra di Yin.
Gli autori prevedono che Action-PAINT potrebbe essere ulteriormente sviluppato in uno strumento ampiamente applicabile che, Per esempio, potrebbe aiutare a modificare direttamente le attività dei recettori di membrana singola sulla superficie delle cellule da dove dirigono il comportamento cellulare, o di canali ionici che controllano la funzione delle cellule neuronali. Inoltre, i metodi potrebbero consentire il trasferimento di maniglie molecolari a singole proteine che potrebbero consentirne l'estrazione e la purificazione insieme ad altre proteine a cui si legano naturalmente.
"Action-PAINT aggiunge un altro livello di funzionalità alle capacità sviluppate dal team di Peng Yin che possono consentire sia la mappatura dell'interazione delle proteine funzionali basata sulla posizione molecolare all'interno delle singole cellule, e l'analisi biochimica di queste interazioni una volta isolate queste molecole, che in futuro potrebbe aiutare a identificare e/o convalidare nuovi bersagli farmacologici, ", ha affermato il direttore fondatore del Wyss Institute, Donald Ingber, M.D., dottorato di ricerca
