Zoë Fisher e Katarina Koruza dell'ESS Deuteration and Macromolecular Crystallization (DEMAX) Support lab e Lund University hanno utilizzato metodi di diffusione del vapore per far crescere grandi cristalli proteici per tecniche di neutroni come parte del pacchetto di lavoro Crystal Growth di SINE2020. Però, oltre ad essere in grado di far crescere cristalli abbastanza grandi per queste tecniche, vogliono anche renderli deuterati. Le versioni deuterate consentono un migliore rapporto segnale-rumore, sfondo incoerente ridotto e l'uso di metodi di variazione del contrasto.

Il team ha tentato di produrre grandi cristalli di varie proteine, tra cui la proteina di membrana Tomato timidina chinasi (TOTK1) e la superossido dismutasi (bSOD) che è presente in tutti gli organismi ed è coinvolta nel processo di invecchiamento. Però, sebbene riuscissero a far crescere dei bei cristalli, semplicemente non erano abbastanza grandi, meno di 0,1 mm3.

Ma Zoë e Katarina hanno avuto molto più successo con le proteine ​​dell'anidrasi carbonica umana (HCA). La proteina HCA IX, in particolare, è implicata nella metastasi del cancro ed è emersa come un possibile bersaglio per il rilevamento del cancro, immagini, e trattamento. Le tecniche dei neutroni potrebbero fornire dettagli sul sito attivo:legame idrogeno, organizzazione dell'acqua, legame con il ligando, che aiuterebbe con la progettazione di farmaci antitumorali migliorati.

tipo selvatico HCA II, HCA IX Mimic (dove parte della molecola HCA II è stata adattata per imitare il sito attivo della proteina HCA IX) e una variante di superficie HCA IX (SV), che ha 6 mutazioni di superficie per renderlo più solubile e stabile, sono state le proteine ​​scelte per il progetto. Quando non è efficiente produrre proteine ​​deuterate producendole da zero o acquistandole commercialmente, vengono deuterati tramite scambio H-D dove viene "imbevuto" in una soluzione deuterata (tampone). Per questo lavoro sono stati tutti espressi in E.coli in condizioni idrogeno e deuterate per realizzare versioni H e D.

Hanno quindi deciso di cristallizzare le proteine ​​utilizzando metodi di diffusione del vapore in modo che i cristalli potessero essere studiati utilizzando sia la cristallografia a raggi X sia quella di neutroni.

Questo non era un compito facile. Le proteine ​​sono molto sensibili. Era necessario utilizzare allestimenti stabili per lunghi periodi di incubazione ed equilibrazione. La temperatura, tassi di evaporazione, Il pH e le concentrazioni di proteine ​​e precipitanti dovevano essere tutti attentamente controllati utilizzando pozzi di cristallizzazione e controllo automatico, ad esempio aumentando e abbassando la temperatura secondo necessità.

Inoltre, per rendere i cristalli abbastanza grandi per la cristallografia di neutroni, è necessario utilizzare un grande volume di materiale di partenza, tipicamente 100-500 microlitri o 100 di mg. Questi grandi volumi significano che la crescita dei cristalli è lenta, quindi le condizioni dovevano essere controllate per molti mesi alla volta.

Sfortunatamente, le rese in cristallo ottenute per le versioni deuterate non erano buone come per le versioni idrogeno, producendo regolarmente cristalli sempre più piccoli. È stato scoperto che per alcune proteine ​​deuterate non era possibile utilizzare le condizioni che funzionavano per le versioni idrogenate e che le condizioni dovevano essere ulteriormente ottimizzate per far crescere i cristalli deuterati.

Ma con perseveranza, Zoë e Katarina sono riuscite a far crescere con successo un cristallo HCA (IX) SV di oltre 1 mm3 e un cristallo di 1,8 mm3 di mimo HCA (IX). Ora sono stati in grado di ottenere risultati di raggi X e anche risultati di neutroni da LADI a ILL e iBIX in Giappone.