(a) Il colorante fluorescente a doppia etichetta nel Q-body basato sul frammento di antigene viene spento durante il legame con l'antigene bersaglio, visualizzando così una segnalazione fluorescente per visualizzare il bersaglio intracellulare. (b) variazione dipendente dalla concentrazione del peptide p53 nell'intensità del segnale di fluorescenza. (c) Q-body mostra un segnale fluorescente elevato sul legame con il bersaglio nelle cellule che esprimono p53, rispetto alle cellule umane negative "p53". (d) Immagini al microscopio confocale di HCT116 p53 e SK-BR-3. Le cellule che non esprimono p53, ovvero HCT116 p53(-/-) non mostrano fluorescenza basata su TAMRA mentre altre (comprese le immagini colorate con colorante Hoechst per illuminare il nucleo e in campo chiaro per mostrare le cellule) mostrano una fluorescenza significativa. Credito:Tokyo Tech
I recenti progressi nella tecnologia di imaging hanno reso possibile visualizzare la dinamica intracellulare, che offre una migliore comprensione di diversi principi biologici chiave per accelerare lo sviluppo terapeutico. L'etichettatura fluorescente è una di queste tecniche che viene utilizzata per identificare le proteine intracellulari, le loro dinamiche e disfunzioni. A questo scopo vengono utilizzate sia sonde interne che esterne con coloranti fluorescenti, sebbene le sonde esterne possano visualizzare meglio le proteine intracellulari rispetto alle sonde interne. Tuttavia, la loro applicazione è limitata dal legame non specifico ai componenti intracellulari, risultando in una segnalazione specifica del bersaglio basso e un rumore di fondo più elevato.
Recentemente, un immunosensore fluorescente marcato con colorante noto come Quenchbody (Q-body) è stato utilizzato con successo per rilevare antigeni in soluzioni o sulla superficie cellulare. Un Q-body è essenzialmente un frammento di anticorpi con la capacità di legare un antigene specifico.
In questo contesto, ricercatori dal Giappone e da Singapore, guidati dal Prof. Hiroshi Ueda del Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech), Giappone, hanno recentemente riportato l'applicabilità dei corpi Q per l'imaging delle proteine intracellulari nelle cellule vive. I loro risultati sono ora pubblicati su Chemical Science .
"Poiché il Q-body funziona come uno strumento di imaging sito-specifico e antigene-dipendente, abbiamo ipotizzato che mostrerà una fluorescenza commutabile antigene-dipendente sull'interazione con la proteina bersaglio, consentendo una visualizzazione precisa della dinamica intracellulare. Lo abbiamo dimostrato sintetizzando un Q-body per p53, una proteina biomarcatore oncosoppressore che svolge un ruolo importante nella riparazione del DNA, nella divisione cellulare e nella morte cellulare", spiega il Prof. Ueda.
Il team ha sintetizzato un "corpo Q" marcato con colorante a fluorescenza chiamato "C11_Fab Q-body", che mostrava una migliore sensibilità e specificità del bersaglio rispetto alle sonde convenzionali nelle cellule tumorali umane che esprimono p53. Poiché l'espressione di p53 aumenta nelle cellule tumorali, hanno elettroporato il corpo Q in diverse linee cellulari tumorali umane per convalidare la loro ipotesi.
Rispetto a una sonda tradizionale che mostrava segnali di fluorescenza continui anche in assenza di p53, la sonda Q-body mostrava segnali di fluorescenza in cellule "fisse" (cellule con proteine denaturate per arrestare la decomposizione) che esprimevano p53. Inoltre, la sonda Q-body potrebbe visualizzare sia il tipo p53 selvaggio (controllo) che quello mutante in campioni di cellule fisse.
Inoltre, il team ha osservato segnali di fluorescenza con un'intensità 8 volte maggiore in linee cellulari di cancro del colon umano vivo con espressione di p53 rispetto ai negativi. È interessante notare che il Q-body era stabile a lungo termine, mostrando cambiamenti di intensità di fluorescenza con cambiamenti sperimentalmente indotti nei livelli di p53.
La citometria a flusso ha rivelato una maggiore immunofluorescenza con Q-body nelle cellule che esprimono p53. Inoltre, durante l'ordinamento, il rapporto e il segnale di fluorescenza di queste cellule era significativamente più alto rispetto alle altre (con o senza Q body).
Il Prof. Ueda afferma:"Le tecniche esistenti non sono in grado di fornire immagini precise di bersagli intracellulari meno abbondanti con elevata specificità e sensibilità. In questo contesto, il nostro studio dimostra il potenziale dei corpi Q nell'imaging delle cellule vive per una migliore visualizzazione dei cambiamenti intracellulari dinamici e fornisce un approccio per lo smistamento intracellulare specifico dell'antigene di cellule vive utilizzando un Q-body."
Guardando al futuro, possiamo aspettarci lo sviluppo di molti più Q-corpi per visualizzare molti altri biomarcatori intracellulari, aprendo le porte a un miglioramento dello sviluppo terapeutico basato sulle cellule e alla ricerca sul cancro. + Esplora ulteriormente
