Figura 1. Un approccio integrato di HS-AFM e docking molecolare per rivelare il meccanismo di legame di Apt-7 a CYP24 (A) La vista tridimensionale delle conformazioni ancorate di alto livello di CYP24 e Apt-7. I siti di legame previsti di Apt-7 sono mostrati dalla freccia. Aptamer si lega al sito di legame del substrato del CYP24 (sito di legame-1) e al sito di legame dell'ADX del CYP24 (sito di legame-2). (B) Confronto della grafica pseudo-HS-AFM di CYP24-Apt-7 utilizzando l'aggancio molecolare generato dalla posa di alto livello del complesso CYP24-Apt-7 con le immagini in tempo reale catturate da HS-AFM. Credito:Università di Kanazawa
I ricercatori dell'Università di Kanazawa in collaborazione con i team dell'Università della Prefettura di Toyama e della BioSeeds Corporation riferiscono in Materiali applicati e interfacce ACS l'identificazione di una molecola con una maggiore attività antiproliferativa nelle cellule tumorali. Il meccanismo biomolecolare sottostante è l'inibizione di un enzima che è sovraprodotto in diversi tipi di cancro.
La vitamina D3 ha importanti funzioni biologiche, incluso il mantenimento della densità minerale ossea, che riduce al minimo il rischio di frattura ossea. Ma si ritiene che la vitamina D3 abbia anche attività antitumorale, poiché bassi livelli di vitamina D3 e la sovrapproduzione associata di un enzima chiamato CYP24 sono collegati a una prognosi sfavorevole per i malati di cancro. Le molecole che limitano o inibiscono l'azione del CYP24 e le molecole che imitano la funzione della vitamina D3 sono oggi altamente ricercate come potenziali agenti antiproliferativi per il trattamento del cancro.
Tuttavia, molti degli inibitori e degli analoghi D3 sintetizzati finora hanno mostrato una risposta clinica insufficiente, nonché effetti collaterali indesiderati. Ora, Madhu Biyani dell'Università di Kanazawa e colleghi hanno identificato una molecola derivata dal DNA che si lega e inibisce la funzione del CYP24 e mostra una promettente attività antiproliferativa. Il team di ricerca fornisce anche approfondimenti dettagliati sui processi molecolari in gioco.
Gli scienziati hanno esaminato un gran numero di aptameri di DNA, frammenti di DNA a filamento singolo con particolari strutture tridimensionali che possono legarsi a specifiche molecole bersaglio e avere un effetto funzionale sul legame. Hanno cercato aptameri del DNA che si legano al CYP24 ma non al simile enzima CYP271B, che è responsabile della sintesi della vitamina D3.
Una lunga lista iniziale di 18 candidati aptameri è stata ridotta a 11 rappresentanti con strutture molecolari specifiche. I ricercatori hanno verificato l'attività di inibizione del CYP24 degli 11 aptameri rappresentativi in vitro. Sono rimasti quattro candidati che hanno portato all'inibizione del CYP24 ma non all'inibizione del CYP27B1, di cui uno (Apt-7) è stato mantenuto per ulteriori studi.
Figura 2. L'internalizzazione dell'aptamero nelle cellule A549 è indispensabile per l'inibizione del CYP24 e per il miglioramento dell'inibizione della crescita cellulare mediata da 1, 25-D3. (A) Interiorizzazione di Aptamer nelle cellule A549. Le cellule di cancro del polmone A549 sono state trattate con aptamer Apt-7 500 nM e le loro membrane erano colorate di verde (coniugati di agglutinina di germe di grano (WGA)). La microscopia confocale ha rivelato il segnale intracellulare, derivato dall'aptamero interiorizzato (fluorescenza rossa, Cy3). (B) Apt-7 inibisce il catabolismo mediato dal CYP24 di 1,25-D3 nelle cellule A549. Dopo 18 h di trattamento con aptamer, il rapporto di conversione del metabolita 1, 25-D3 e l'attività relativa del CYP24 sono stati determinati mediante HPLC. (C) Apt-7 migliora la funzione anti-proliferativa di 1, 25-D3 nelle cellule A549. Credito:Università di Kanazawa
Biyani e colleghi hanno eseguito simulazioni del legame di Apt-7 al CYP24. È stato ottenuto uno scenario di docking molecolare, che hanno verificato sperimentalmente confrontando il comportamento di una miscela di vitamina D3 e CYP24 con e senza Apt-7. Le simulazioni e gli esperimenti hanno mostrato che l'Apt-7 provoca l'inibizione dell'attività del CYP24 e che ciò che accade è che l'aptamero probabilmente interferisce con il sito attivo dell'enzima. I ricercatori hanno anche eseguito la microscopia a forza atomica ad alta velocità sul legame di CYP24 e Apt-7 in tempo reale, confermando lo scenario di docking molecolare ottenuto dalle simulazioni.
Infine, il team di ricerca ha studiato l'effetto di Apt-7 a livello cellulare introducendo la molecola nelle cellule tumorali. Hanno osservato una significativa inibizione del CYP24 per una linea cellulare cancerosa nota per sovraesprimere l'enzima CYP24, mostrando così un'attività antiproliferativa. Citando Biyani e colleghi, questi risultati "hanno chiaramente caratterizzato e proposto che una molecola a base di aptameri di DNA potrebbe essere un promettente candidato principale per la terapia antitumorale". + Esplora ulteriormente
