1. Tampone di lisi:
* Funzione: Rompi le cellule aperte e rilascia il DNA.
* Componenti:
* Detergente: Interrompe le membrane cellulari (ad es. SDS, Triton X-100).
* Salt: Aiuta a neutralizzare le molecole cariche e stabilizza il DNA (ad es. NaCl).
* Tris Buffer: Mantiene il pH per un'attività enzimatica ottimale.
* EDTA: Agente chelante che si lega a cationi bivalenti come il magnesio, prevenendo la degradazione del DNA da parte di DNasi.
2. Proteinasi K:
* Funzione: Digerisce le proteine, compresi gli istoni che si legano al DNA.
* Meccanismo: Una proteasi serina che scinde il peptide si lega all'interno delle proteine.
* Scopo: Rimuove le proteine che possono interferire con l'isolamento e la purificazione del DNA.
3. Fenolo/cloroformio:
* Funzione: Separa il DNA da proteine e altri detriti cellulari.
* Meccanismo: Le proteine del fenolo denature e le rendono insolubili, mentre il cloroformio funge da denaturante e aiuta a separare le fasi acquose e organiche.
* Procedura: Dopo aver agitato vigoroso, la miscela si separa in tre strati:
* Strato superiore:fase acquosa contenente DNA.
* Strato medio:interfase contenenti proteine denaturate.
* Strato inferiore:fase organica contenente fenolo/cloroformio.
* Il DNA viene recuperato dallo strato acquoso.
4. Etanolo/isopropanolo:
* Funzione: Precipita il DNA dalla soluzione.
* Meccanismo: Il DNA è solubile in acqua ma insolubile in etanolo o isopropanolo. Quando aggiunti, questi alcoli riducono la solubilità del DNA, causando il precipitare dalla soluzione.
* Procedura: Dopo aver aggiunto etanolo o isopropanolo, la miscela è centrifugata per raccogliere il pellet di DNA.
5. TE tampone:
* Funzione: Respenso e memorizza il DNA dopo l'estrazione.
* Componenti:
* Tris Buffer: Mantiene il pH per una stabilità ottimale del DNA.
* EDTA: Agente chelante che inibisce i DNasi.
* Scopo: Garantisce che il DNA rimane intatto e protetto dal degrado durante la conservazione.
6. Rnase A:
* Funzione: Rimuove la contaminazione dell'RNA.
* Meccanismo: Un enzima che degrada specificamente l'RNA.
* Scopo: Garantisce un campione di DNA puro per applicazioni a valle come PCR o sequenziamento.
Nota: Alcuni protocolli possono utilizzare altri prodotti chimici come la guanidina cloridrato o il tiocianato di guanidina per la lisi o colonne di silice per il legame e la purificazione del DNA anziché il fenolo/cloroformio.
