Di Tricia Lobo, aggiornato il 30 agosto 2022
Gli enzimi accelerano le reazioni chimiche abbassando l'energia di attivazione. La maggior parte degli enzimi funziona meglio tra 35°C e 40°C, un intervallo in cui l'aumento dell'energia cinetica migliora il legame con il substrato senza causare denaturazione. Il superamento di questa finestra può dispiegare in modo irreversibile la proteina e arrestarne l'attività.
Selezionare un metodo affidabile per quantificare la formazione del prodotto in ciascun punto di temperatura. Le opzioni comuni includono la spettrofotometria (conversione dell'assorbanza in concentrazione utilizzando una curva di calibrazione) o test di fluorescenza che correlano l'intensità con la quantità di prodotto.
Combinare l'enzima e il substrato in una fiala di scintillazione sigillata per prevenire l'evaporazione. Posizionare la fiala in un bicchiere più grande pieno d'acqua e montare il bicchiere su una piastra riscaldante. Inserisci un termometro calibrato nel bicchiere per monitorare accuratamente la temperatura della soluzione.
Iniziare prelevando un'aliquota da 100 µl a temperatura ambiente (~25°C). Attivare la piastra riscaldante e raccogliere 100 µl di campioni a temperature incrementali (30,5 °C, 31 °C, 31,5 °C e così via) fino a raggiungere i 40 °C. Assicurarsi che ogni campione venga elaborato immediatamente per evitare variazioni di temperatura.
Determinare la concentrazione del prodotto per ciascuna aliquota utilizzando il dosaggio scelto. Tracciare la concentrazione (o la velocità di reazione) rispetto alla temperatura. Il picco di questa curva identifica la temperatura ottimale dell’enzima. Temperature superiori a 40°C mostrano tipicamente un calo dell'attività, indicando l'inizio della denaturazione.
