I microscopi ottici e le pinzette possono visualizzare e manipolare oggetti su microscala per applicazioni in biologia cellulare e molecolare. La risoluzione ottica è però, ostacolato dal limite di diffrazione e quindi sia i microscopi che le pinzette non sono in grado di visualizzare e manipolare direttamente i nano-oggetti. Le tecniche emergenti nei nanoscopi plasmonici/fotonici e nelle nanopinze mirano a raggiungere una risoluzione su scala nanometrica, sebbene le strutture dei materiali ad alto indice possano facilmente causare danni meccanici e fototermici ai campioni biologici su scala nanometrica.

In un recente studio ora pubblicato su Luce:scienza e applicazioni , Yuchao Li e colleghi dell'Istituto di nanofotonica in Cina, ha sviluppato un sistema di microscopio ottico utilizzando cellule viventi come minuscole lenti per visualizzare e manipolare oggetti più piccoli della lunghezza d'onda della luce. Hanno mostrato l'imaging del limite di diffrazione e la manipolazione di nano-oggetti con un dispositivo non invasivo, che hanno costruito intrappolando una cellula su una punta di fibra. La cellula intrappolata ha formato un biomagnifier in grado di ingrandire le nanostrutture con una risoluzione di 100 nm, al microscopio a luce bianca. Usando il biomagnifier, Li et al. formato una trappola nano-ottica per manipolare con precisione una singola nanoparticella con un raggio di 50 nm. La tecnica fornisce uno strumento di alta precisione per l'imaging ottico, rilevamento e assemblaggio di bio-nanomateriali senza danni meccanici o fototermici.

L'imaging ottico per manipolare piccoli oggetti è fondamentale per la diagnosi medica, rilevamento biologico, esplorazione cellulare, formazione molecolare e assemblaggio di materiali. Pinzette e microscopi sono dispositivi standard per l'imaging senza contatto e la manipolazione di campioni minuti che vanno da pochi nanometri a diversi micron. Tuttavia, è difficile utilizzare la tecnologia per immagini su scala nanometrica, poiché la risoluzione ottica è limitata a circa la metà della lunghezza d'onda di illuminazione.

Negli ultimi decenni, gli scienziati hanno compiuto notevoli progressi con i nanoscopi a campo vicino e le nanopinzette per ottenere l'imaging ottico con una risoluzione nanometrica. Queste tecniche di imaging sono state trattenute da materiali inorganici ad alto indice come metalli nobili e semiconduttori utilizzati per la loro fabbricazione, che possono danneggiare meccanicamente campioni di cellule o tessuti biologici durante l'imaging e la manipolazione in campo vicino.

Gli scienziati hanno quindi studiato schemi di imaging ottico più semplici basati su microsfere dielettriche per superare il limite di diffrazione comune ai microscopi convenzionali. Sebbene la tecnica sia priva di etichette e fattibile, tali microsfere sono basate su materiali inorganici artificiali come il biossido di silicio (SiO ₂ ), biossido di titanio (TiO ₂ ) e titanato di bario (BaTiO ₃ ). I ricercatori sono quindi interessati allo sviluppo di un biomateriale naturale per costruire un dispositivo biocompatibile per il bioimaging, manipolazione e biomagnificazione a risoluzione spaziale su scala nanometrica.

Li et al. cellule biologiche selezionate per sostituire le microsfere poiché le cellule sono sia abbondanti che biocompatibili a contatto con i sistemi biologici. Ad esempio, gli scienziati possono utilizzare le cellule viventi per manipolare la luce negli ambienti biologici e agire come microlenti optofluidiche, sonde ottiche e persino incorporare E.coli come guide d'onda biofotoniche. Nel presente lavoro, Li et al. migliorato il contrasto indice delle cellule viventi utilizzando una forma sferica semi-immersa in un mezzo per ottenere la messa a fuoco alla sub-lunghezza d'onda. Gli scienziati hanno catturato immagini biologiche utilizzando il punto luminoso di subdiffrazione per illuminare campioni mirati insieme alla microscopia a luce bianca. Il punto luminoso di dimensioni nanometriche ha esercitato una forte forza del gradiente ottico per intrappolare e manipolare una singola nanoparticella, consentendo al biomagnifier di funzionare anche come nanopinzetta ottica.

Gli scienziati hanno condotto tutti gli esperimenti sotto un microscopio ottico a riflessione accoppiato a una fotocamera con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) e a un obiettivo. Hanno usato sorgenti luminose a 390 nm, 560 nm e 808 nm per l'eccitazione, rispettivamente l'illuminazione e l'intrappolamento. Utilizzando una fibra ottica con punta rastremata, Li et al. intrappolato il biomagnifier all'estremità della fibra, che controllavano muovendo la punta usando un micromanipolatore. Li et al. selezionate celle lisce e sferiche per ridurre al minimo l'aberrazione dell'immagine e notato che le celle mostrano migliori prestazioni di messa a fuoco quando semi-immerse in una soluzione per mantenere la vitalità cellulare.

Durante l'imaging sperimentale, gli scienziati hanno posizionato un biomagnifier semisommerso sopra un campione di prova e hanno raccolto le informazioni sottostanti del campo vicino dal campione, per formare un'immagine virtuale rilevata da un microscopio ottico. Li et al. preparato una varietà di biomagnifiers utilizzando diverse cellule tra cui batteri, lievito, globuli rossi e cellule staminali. Per il primo campione di imaging, hanno utilizzato un array di nanosfere di silice esagonale bidimensionale con un diametro di 200 nm su un substrato di vetro utilizzando una tecnica fotoforetica.

Solo le nanosfere con sopra dei biomagnificatori potrebbero essere risolte durante l'imaging, considerando che le nanosfere senza biomagnifier non potrebbero essere risolte utilizzando un microscopio convenzionale. Il fattore di ingrandimento M dei biomagnifier basati su cellule staminali è stato determinato essere 3,3 volte più grande (x3,3), e gli scienziati hanno mostrato che la M sperimentale dipendeva dal diametro del biomagnifier. Successivamente, Li et al. eseguito tutti gli esperimenti utilizzando biomagnifier di questo diametro.

Per studiare le applicazioni dei biomagnifier, Li et al. immagini di cellule epiteliali umane come bersagli di imaging mediante la crescita di cellule epiteliali su un substrato a specchio per interazioni luce-materia migliorate tramite l'interferenza della luce di illuminazione e della luce riflessa. Mentre era difficile distinguere il citoscheletro fibroso e le strutture a doppio strato sotto un microscopio ottico convenzionale, dopo aver posizionato un biomagnifier sopra le cellule epiteliali, gli scienziati sono stati in grado di risolvere entrambe le strutture. Per migliorare il campo visivo dell'immagine (FOV), hanno intrappolato il biomagnifier su una punta di fibra e lo hanno spostato per scansionare i campioni. Per esempio, Li et al. ha usato la configurazione per scansionare lettere con nanomodelli che stavano per un acronimo di Jinan University—JNU, che hanno creato per la prima volta sul silicio utilizzando la litografia a fascio di elettroni.

Successivamente, quando hanno irradiato simultaneamente raggi laser nel vicino infrarosso (IR) e UV sul biomagnifier attraverso una lente dell'obiettivo, potrebbero intrappolare ed eccitare le nanoparticelle. Per questi esperimenti, gli scienziati hanno utilizzato nanoparticelle fluorescenti con un raggio medio di 50 nm. Quando hanno intrappolato una singola nanoparticella nel fuoco di un biomagnifier, hanno osservato immagini sia ottiche che fluorescenti del campione di interesse. Li et al. quindi calcolato la rigidità di intrappolamento della particella in tempo reale utilizzando pinzette ottiche standard. La capacità di manipolare una singola nanoparticella senza contatto e precisamente tramite l'ottica sarà utile per assemblare nanostrutture ben regolate. Quando Li et al. ha studiato numericamente il meccanismo di imaging e la rigidità di intrappolamento dei biomagnifier utilizzando la simulazione 3D e il software COMSOL. Hanno osservato che la capacità di focalizzazione della luce al limite della subdiffrazione risultava da un effetto combinato di "nanojet fotonico" e dal miglioramento dell'interferenza coerente da parte dello specchio.

I limiti del metodo includevano l'aberrazione e la distorsione dell'immagine dovute alle strutture intracellulari disomogenee del biomagnifier naturale, rispetto alle microsfere dielettriche con indici di rifrazione uniformi. Fortunatamente, i materiali intracellulari erano otticamente trasparenti alla luce visibile e al vicino infrarosso e le interazioni ottiche erano relativamente deboli all'interno di una singola cellula. Le attività intracellulari potrebbero anche modificare la distribuzione parziale dell'indice di rifrazione in una cellula per causare la distorsione della luce durante l'intrappolamento e l'imaging, ma la maggior parte delle attività intracellulari erano ultraveloci e non influenzavano lo schema di imaging.

In questo modo, Yuchao Li e colleghi hanno sviluppato una nuova tecnica di imaging sperimentale e hanno verificato le capacità sperimentali con simulazioni FEM. Li et al. nanoscopi ottici e nanopinzette integrati in un unico dispositivo per l'immagine e la manipolazione simultanea di nanostrutture per la prima volta nel presente lavoro. Hanno promosso la risoluzione della tecnica a 100 nm e proposto una procedura di imaging senza etichetta. Gli scienziati immaginano il biomagnifier vivente per aprire nuove opportunità nell'imaging a super risoluzione, rilevamento in tempo reale e nanoassemblaggio preciso di bionanomateriali per formare nanoarchitetture di interesse.

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