I ricercatori hanno sviluppato un metodo semplice per acquisire simultaneamente immagini a diverse profondità con un microscopio standard. La nuova tecnica può essere applicata a una varietà di metodi di microscopia, rendendolo utile per una vasta gamma di applicazioni di imaging biologico e biomedico.

"La microscopia ottica è stata uno strumento indispensabile per studiare sistemi e processi biologici complessi in 3D, " disse Sheng Xiao, un membro del gruppo di ricerca della Boston University. "La nostra nuova tecnica multifocus consente di osservare le cellule e gli organismi vivi ad alta velocità e con alto contrasto".

In ottica , La rivista della Optical Society (OSA) per la ricerca ad alto impatto, i ricercatori guidati da Jerome Mertz descrivono il loro nuovo modo semplice e veloce per acquisire informazioni da diverse profondità con la microscopia standard. Il nuovo approccio può essere semplicemente aggiunto alla maggior parte dei sistemi esistenti ed è facile da replicare, rendendolo accessibile ad altri ricercatori.

Acquisizione di immagini multifocus

I sistemi di microscopia basati su fotocamera standard acquisiscono immagini nitide su un singolo piano focale. Sebbene i ricercatori abbiano provato varie strategie per acquisire contemporaneamente immagini con diverse profondità focali, questi approcci in genere richiedono più fotocamere o utilizzano un elemento ottico diffrattivo specializzato per eseguire la divisione dell'immagine con una singola fotocamera. Entrambe le strategie sono complesse, e un elemento ottico diffrattivo può essere difficile da fabbricare.

"Abbiamo utilizzato un prisma z-splitter che può essere assemblato interamente da componenti standard e può essere facilmente applicato a una varietà di modalità di imaging come fluorescenza, imaging a contrasto di fase o in campo oscuro, " disse Xiao.

Il prisma z-splitter divide la luce rilevata per produrre contemporaneamente più immagini in un'unica inquadratura della telecamera. Ogni immagine viene messa a fuoco a una profondità diversa nel campione. L'utilizzo di una fotocamera ad alta velocità con un'ampia area del sensore e un elevato numero di pixel ha consentito ai ricercatori di distribuire più immagini ad alta risoluzione sullo stesso sensore senza alcuna sovrapposizione.

Le immagini multifocali acquisite con la nuova tecnica consentono di stimare lo sfondo sfuocato dal campione in modo molto più accurato di quanto si possa fare con una singola immagine. I ricercatori hanno utilizzato queste informazioni per sviluppare un algoritmo di sfocatura 3D migliorato che elimina la luce di sfondo sfocata che è spesso un problema quando si utilizza la microscopia a campo largo.

"Il nostro algoritmo di deblur 3D a volume esteso elimina lo sfondo molto fuori fuoco da fonti oltre il volume di imaging, " ha detto Xiao. "Questo migliora sia il contrasto dell'immagine che il rapporto segnale-rumore, rendendolo particolarmente utile nelle applicazioni di imaging a fluorescenza che coinvolgono campioni spessi."

Versatilità dimostrata

I ricercatori hanno dimostrato la nuova tecnica con modalità di microscopia comunemente usate, compresa la fluorescenza, immagini a contrasto di fase e in campo oscuro. Hanno catturato immagini 3D a grande campo visivo che comprendono centinaia di neuroni o interi organismi in movimento libero, nonché immagini 3D ad alta velocità di ciglia di rotifero, che batte ogni centesimo di secondo. Ciò ha mostrato come l'approccio offra la flessibilità necessaria per dare la priorità a un ampio campo visivo o ad alta velocità.

Per dimostrare le capacità dell'algoritmo di sfocatura 3D del volume esteso, i ricercatori hanno ripreso vari campioni spessi, compreso il cervello di un topo vivente. Hanno osservato miglioramenti significativi del contrasto e del rapporto segnale-rumore rispetto sia alle immagini multifocus non elaborate che ai più tradizionali algoritmi di deblur 3D. I ricercatori stanno ora lavorando per espandere la tecnica in modo che funzioni con ancora più modalità di imaging.