I microscopi convenzionali forniscono informazioni essenziali sui campioni in due dimensioni:il piano del vetrino del microscopio. Ma piatto non è tutto questo. In molti casi, le informazioni sull'oggetto nella terza dimensione, l'asse perpendicolare al vetrino del microscopio, sono altrettanto importanti da misurare.

Per esempio, comprendere la funzione di un campione biologico, se si tratta di un filamento di DNA, fazzoletto di carta, organo o organismo microscopico, i ricercatori vorrebbero avere quante più informazioni possibili sulla struttura tridimensionale e sul movimento dell'oggetto. Le misurazioni bidimensionali producono una comprensione incompleta e talvolta insoddisfacente del campione.

Ora i ricercatori del National Institute of Standards and Technology (NIST) hanno trovato un modo per convertire un problema che colpisce quasi tutti i microscopi ottici:le aberrazioni delle lenti, che causano una messa a fuoco imperfetta della luce, in una soluzione che consente ai microscopi convenzionali di misurare con precisione le posizioni dei punti di luce su un campione in tutte e tre le dimensioni.

Sebbene altri metodi abbiano consentito ai microscopi di fornire informazioni dettagliate sulla struttura tridimensionale, queste strategie tendono ad essere costose o richiedono conoscenze specialistiche. In un precedente approccio alla misurazione delle posizioni nella terza dimensione, i ricercatori hanno alterato l'ottica dei microscopi, per esempio aggiungendo ulteriore astigmatismo alle lenti. Tali alterazioni spesso richiedevano la reingegnerizzazione e la ricalibrazione del microscopio ottico dopo che aveva lasciato la fabbrica.

Il nuovo metodo di misurazione consente inoltre ai microscopi di individuare in modo più accurato e preciso le posizioni degli oggetti. I microscopi ottici in genere risolvono le posizioni degli oggetti in una regione non inferiore a poche centinaia di nanometri (miliardesimi di metro), un limite fissato dalla lunghezza d'onda della luce che fa l'immagine e dal potere risolutivo delle lenti del microscopio. Con la nuova tecnica, i microscopi convenzionali possono individuare le posizioni delle singole particelle che emettono luce all'interno di una regione un centesimo più piccola.

I ricercatori del NIST Samuel Stavis, Craig Copeland e i loro colleghi hanno descritto il loro lavoro nel numero del 24 giugno di Comunicazioni sulla natura .

Il metodo si basa su un'attenta analisi delle immagini di particelle fluorescenti che i ricercatori hanno depositato su wafer di silicio piatti per la calibrazione del loro microscopio. A causa delle aberrazioni dell'obiettivo, mentre il microscopio si muoveva su e giù con incrementi specifici lungo l'asse verticale - la terza dimensione - le immagini apparivano sbilenche e le forme e le posizioni delle particelle sembravano cambiare. I ricercatori del NIST hanno scoperto che le aberrazioni possono produrre grandi distorsioni nelle immagini anche se il microscopio si sposta di pochi micrometri (milionesimi di metro) nel piano laterale o di poche decine di nanometri nella dimensione verticale.

L'analisi ha permesso ai ricercatori di modellare esattamente come le aberrazioni della lente hanno alterato l'aspetto e la posizione apparente delle particelle fluorescenti con cambiamenti nella posizione verticale. Calibrando attentamente l'aspetto mutevole e la posizione apparente di una particella nella sua posizione verticale, il team è riuscito a utilizzare il microscopio per misurare con precisione le posizioni in tutte e tre le dimensioni.

"Controintuitivamente, le aberrazioni dell'obiettivo limitano la precisione in due dimensioni e consentono la precisione in tre dimensioni, " disse Stavis. "In questo modo, il nostro studio cambia la prospettiva della dimensionalità delle immagini al microscopio ottico, e rivela il potenziale dei normali microscopi per effettuare misurazioni straordinarie."

L'utilizzo delle informazioni latenti fornite dalle aberrazioni della lente integra i metodi meno accessibili che i microscopisti attualmente impiegano per effettuare misurazioni nella terza dimensione, ha notato Stavis. Il nuovo metodo ha il potenziale per ampliare la disponibilità di tali misurazioni.

Gli scienziati hanno testato il loro metodo di calibrazione utilizzando il microscopio per visualizzare una costellazione di particelle fluorescenti depositate casualmente su un microscopico ingranaggio di silicio che ruotava in tutte e tre le dimensioni. I ricercatori hanno dimostrato che il loro modello ha corretto accuratamente le aberrazioni dell'obiettivo, consentendo al microscopio di fornire informazioni tridimensionali complete sulla posizione delle particelle.

I ricercatori sono stati quindi in grado di estendere le misurazioni della loro posizione per catturare l'intera gamma di movimento dell'ingranaggio, compresa la sua rotazione, ondeggiando e dondolando, completare l'estrazione delle informazioni spaziali dal sistema. Queste nuove misurazioni hanno evidenziato le conseguenze dei divari su scala nanometrica tra le parti del microsistema, che variava a causa di imperfezioni nella fabbricazione del sistema. Proprio come un cuscinetto allentato su una ruota la fa vacillare, lo studio ha mostrato che gli spazi su scala nanometrica tra le parti non solo hanno degradato la precisione della rotazione intenzionale, ma ha anche causato oscillazioni involontarie, oscillazione e persino flessione dell'ingranaggio, tutto ciò potrebbe limitarne le prestazioni e l'affidabilità.

I laboratori di microscopia potrebbero facilmente implementare il nuovo metodo, disse Copeland. "L'utente ha solo bisogno di un campione standard per misurare i propri effetti e di una calibrazione per utilizzare i dati risultanti, " aggiunse Stavis. A parte le particelle fluorescenti o uno standard simile, che già esistono o stanno emergendo, non è necessaria alcuna attrezzatura aggiuntiva. Il nuovo articolo di giornale include un software dimostrativo che guida i ricercatori su come applicare la calibrazione.