Lo schema rappresenta una griglia di affinità EM (quadrato grigio) rivestita con molecole adattatrici (rosso e blu scuro) che ancorano i DLP attivi del rotavirus (giallo) alla griglia di affinità. L'immagine della microscopia crioelettronica (EM) di DLP a trascrizione attiva rivela filamenti di RNA (fili grigi) che emergono dal capside del virus. Le ricostruzioni di immagini tridimensionali di DLP (azzurro) che producono attivamente RNA rivelano una forte densità all'interno del nucleo virale. Il diametro di ogni ricostruzione è di ~80 nm. Credito:Deborah F. Kelly, Virginia Tech Carilion Research Institute, Virginia Tech.
I ricercatori del Virginia Tech Carilion Research Institute (VTCRI) stanno utilizzando nuovi approcci di imaging su nanoscala per far luce sulle attività dinamiche dei rotavirus, importanti patogeni che causano diarrea pericolosa per la vita nei bambini piccoli. Una volta che un rotavirus entra in una cellula ospite, perde il suo strato proteico più esterno, lasciando dietro di sé una particella a doppio strato (DLP). Questi DLP sono la forma del virus che produce molecole di RNA messaggero, che sono fondamentali per avviare l'infezione.
Ricercatori, Deborah Kelly, dottorato di ricerca e Sarah McDonald, dottorato di ricerca, entrambi Assistant Professor presso VTCRI, istantanee molecolari acquisite di DLP da rotavirus, nel mezzo della produzione di RNA virale, utilizzando la crio-microscopia elettronica (crio-EM). Il team che ha svolto il lavoro comprendeva anche studenti di medicina del terzo anno, Joanna Kam e Andrew Demmert, della Virginia Tech Carilion School of Medicine, e borsista post-dottorato, Justin Tanner, dottorato di ricerca
Per ottenere la migliore visualizzazione possibile dei dettagli su scala nanometrica dei DLP attivi del rotavirus, Kelly ha sviluppato una tecnica che ha permesso la visualizzazione dei cambiamenti nel guscio più esterno. In combinazione con nuovi approcci computazionali, gli scienziati sono stati anche in grado di rilevare le caratteristiche interne dei DLP, che non era stato precedentemente osservato. interessante, le caratteristiche interne della DLP sono cambiate in un modo che corrispondeva a differenze osservabili nei livelli di produzione di RNA messaggero virale.
Questi risultati forniscono nuove intuizioni strutturali sui meccanismi della sintesi dell'RNA del rotavirus, che a sua volta può fornire informazioni su come questo processo virale avviene al momento dell'infezione della cellula ospite. I risultati appaiono nell'ultima edizione della rivista Tecnologia .
"La cosa notevole di questo studio è che siamo stati in grado di vedere diversi livelli di complessità all'interno dei DLP correlati alla sintesi dell'RNA virale, " ha detto Kelly. "Quando i virus erano attivi, le loro strutture esterne si muovevano dinamicamente, in un modo che è diventato meno organizzato. Mentre allo stesso tempo, le caratteristiche forti all'interno dei loro nuclei interni diventano più importanti."
Un approccio innovativo chiave utilizzato dal laboratorio Kelly ha fornito la possibilità di visualizzare uno spettro più ampio di strutture virali. Esaminando i DLP attaccati agli anticorpi su una superficie stabile della griglia, i ricercatori sono stati in grado di visualizzare le nanomacchine in ciclo attraverso i loro processi naturali.
Kelly e McDonald hanno anche utilizzato un nuovo algoritmo informatico per classificare i DLP, indipendentemente, che ha evitato la distorsione da parte dell'utente nei calcoli sperimentali. L'approccio computazionale basato sulla statistica ha classificato i campioni in base ai livelli di produzione di RNA. I risultati hanno mostrato chiaramente che le DLP del rotavirus con uno strato proteico esterno meno organizzato avevano dettagli più solidi nei loro nuclei interni. Questi DLP sono stati trovati anche nelle immagini cryo-EM per essere vicini a più filamenti di RNA.
"Per molti anni gli scienziati si sono occupati di risultati ad alta risoluzione e non hanno prestato molta attenzione alla sottile diversità che esiste nei campioni di virus, "ha detto Mc Donald, che è anche assistente professore di scienze biomediche e patobiologia presso il Virginia–Maryland Regional College of Veterinary Medicine. "Ma quella diversità può essere indicativa di come i virus funzionino effettivamente all'interno delle cellule. Non sono statici, ma dinamico in natura."
"È un po' controintuitivo, " ha detto Kelly, che è anche assistente professore di scienze biologiche presso il College of Sciences della Virginia Tech. "Lo immagineresti, se le parti biologiche si muovessero, quindi le caratteristiche si dissiperebbero. Quando questi riarrangiamenti si verificano in uno spazio così ristretto, però, può potenzialmente portare a un livello più alto di organizzazione. E i cambiamenti coordinati all'esterno dei virus sembrano consentire questi processi".
Secondo Kelly, questi risultati forniscono nuove informazioni sui processi sintetici dell'RNA del rotavirus e possono rivelarsi utili nella nostra comprensione della biologia virale in generale. Migliorare la nostra comprensione del funzionamento interno del rotavirus, lei ha aggiunto, potrebbe anche fornire nuovi obiettivi per lo sviluppo di trattamenti per le malattie diarroiche indotte da virus.
